对于可切除的软骨肉瘤（CHS）患者，手术切除是治疗的有效手段，但对于不能通过手术切除的软骨肉瘤患者，他们对放疗和化疗具有一定的抗性。最近有病例报道，PD-1免疫治疗能够导致软骨瘤的肿瘤消退和完全反应，表明免疫治疗对难治性恶性肿瘤具有一定积极治疗作用。因此，对软骨瘤患者进行全面的免疫学评估，确定的潜在的治疗方案，进而针对不同免疫微环境患者开发针对性免疫治疗方案是非常必要的。
近日，浙江大学医学院附属第二医院叶招明和林秾教授团队基于CyTOF、WES、FACS、IHC技术，对98例人软骨肉瘤样本、4例人内生软骨瘤样本以及4例人软骨母细胞瘤样本进行了免疫系统深度剖析，以期挖掘预测免疫治疗响应的生物标志物，其研究成果发表在《Clinical Cancer Research》（IF=12.53）上。CyTOF检测和分析服务由普罗亭完成。
文章研究思路
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CyTOF揭示CHS的三种免疫表型
为明确CHS免疫细胞表型，研究人员利用CyTOF对22例来自WHOⅠ级（n=7）、Ⅱ级（n=14）和Ⅲ级（n=1）新鲜肿瘤标本进行分析。共鉴定出包括T细胞、CD11c+cDCs和一些髓系细胞在内的11个CD45+细胞亚群（Fig.1B/C），但未检测到巨噬细胞和单核细胞。流式结果表明，CHS中几乎没有B细胞、NK细胞、NKT细胞、中性粒细胞和M-MDSCs（Fig.1D-E）。
根据免疫细胞表型，研究人员将CHS肿瘤免疫表型分为I、II、III三个亚型。其中III亚型为“冷”型肿瘤，几乎没有免疫细胞浸润，处于“免疫沙漠”状态；I和II亚型免疫细胞丰富，I亚型G-MDSCs细胞富集、II型富集大量的DCs和T细胞（Fig.1G）。
Fig.1 CyTOF构建CHS的免疫图谱
CyTOF揭示不同软骨肿瘤的免疫图谱差异
为了进一步研究不同类型软骨肿瘤的免疫特征差异，研究人员剖析研究了内生软骨瘤、软骨肉瘤以及软骨母细胞瘤的免疫细胞组成。在鉴定出的25种CD45+免疫细胞中，M1和M2巨噬细胞仅在软骨母细胞瘤中出现，G-MDSCs仅见于CHS中，对于CD8+T细胞，软骨母细胞瘤中活化的亚型明显多于CHS，且CHS中CD8+T细胞的大部分亚型是耗竭表型（Fig.2B/E）。这些结果表明，“G-MDSC富集”I 型和“免疫衰竭”II 型表型仅见于CHS中。
Fig.2 软骨肉瘤、内生软骨瘤和软骨母细胞瘤瘤内免疫细胞的比较
WES&CyTOF&FACS探究异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变与免疫应答和趋化因子水平相关性
由于基因突变可能会影响免疫细胞的功能，为了进一步找出与CHS免疫亚型有关的潜在标志物，研究人员对22例经过CyTOF免疫剖析的样本进行了全外显子组测序（WES），与其它突变相比，IDH1/2突变频率最高（Fig.3A)。将突变与CyTOF数据关联分析发现，相比于野生型IDH1/2，IDH1/2突变型软骨肉瘤免疫细胞富集（Fig.3D/E）。
随后研究人员对瘤内细胞的趋化因子进行评估以探究为什么IDH1/2突变肿瘤具有更多的免疫细胞。研究发现IDH1/2突变型肿瘤微环境表达更高水平的CXCL9和CXCL12。此外，高表达水平的肿瘤代谢物D-2-羟基戊二酸（D-2-HG）仅在IDH1/2突变的CHS中存在，且其表达水平与在免疫识别抗原呈递中起重要作用的cDCs以及趋化因子CXCL12水平呈正相关（Fig. 3H/I）。
Fig.3 软骨肉瘤基因突变及其与免疫细胞的关系
免疫细胞表型临床特征关联性分析
研究人员进一步研究了肿瘤分级、瘤周水肿和粘液样变三个临床特征，以探究这些特征能否帮助预测肿瘤患者的免疫状态。研究发现高分化级别以及瘤周水肿患者，免疫细胞浸润更多，尤其是CD8+T细胞和cDCs（Fig.4C/F）。此外，粘液样变样本几乎没有免疫细胞浸润。
前面的研究证明这三个临床特征能够小队列预测免疫状态，那在大队列研究中是否也成立呢？通过对77例样本的研究发现，具有更高级别、瘤周水肿或粘液样转化的病例具有更多的T细胞和PD-1+TIM-3+Tex细胞富集（Fig.4L）。
Fig.4 临床表现与免疫细胞的相关性
通过与CHS的三种免疫亚型与临床特征匹配研究，免疫细胞浸润亚型（Ⅰ、Ⅱ亚型）病例均为高级别肿瘤，广泛的瘤周水肿仅见于免疫反应性个体，I型G-MDSC以黏液样变为特征。此外，在无粘液样变的病例中，IDH突变和高度分化级别患者具有耗竭型免疫微环境（亚型II）（Fig.5）。
Fig.5 临床特征的生物标志物有助于CHS的免疫分型
PD-1免疫疗法仅在II型患者中显示出疾病控制
研究人员进一步分析了免疫系统的分类是否可以帮助预测免疫治疗响应。研究人员入组了12例不可切除的CHS患者，并通过临床特征、基因组信息等进行了患者的免疫分型，研究了免疫治疗后的疾病进展。研究发现免疫治疗后得到控制的三个患者都属于II型"免疫衰竭“类型，而I型或III亚型病例均未观察到肿瘤控制（Fig.6）。
Fig.6 三例CHS病例受益于免疫疗法
IDH突变诱导的免疫应答具有CXCL2依赖性
最后研究人员通过小鼠癌细胞系构建的小鼠同质模型评估了基于PD-1免疫治疗的免疫依赖性。研究发现小鼠肿瘤组织中CXCL12表达水平显著升高，CXCL12基因敲除能够减弱IDH突变对瘤内免疫细胞的富集，且肿瘤浸润DC（TIDC）输注和PD-1抗体免疫疗法以及联合治疗不能延缓CXCL12小鼠敲除模型的存活期。此外，OVA特异性OT-I细胞研究发现过继细胞免疫治疗显著延长了小鼠存活时间，但CXCL12拮抗剂部分消除了抗肿瘤作用。
Fig.7 IDH突变介导的免疫应答具有趋化因子依赖性
文章总结
该研究中，研究人员基于CyTOF和流式细胞技术，将CHS肿瘤免疫微环境分为三种表型：I型，“G-MDSC细胞富集”型，其HLA-DR-CD14-髓系细胞富集；Ⅱ型：“免疫耗竭”型，耗竭性T细胞和树突状细胞浸润；Ⅲ型：“免疫沙漠”型，几乎无免疫细胞浸润。将临床特征与免疫细胞分型关联分析发现，免疫细胞丰富的亚型（亚型I和亚型II）以IDH突变、病理高度分级和瘤周水肿为特征，且亚型I特异性表现为黏液样变。在接受抗PD-1免疫治疗并症状缓解患者的免疫表型为II亚型。此外，对其机制进一步研究发现IDH突变显著提高了免疫失活肿瘤中趋化因子表达水平和免疫细胞浸润。
该研究绘制了软骨肉瘤全面综合的免疫图谱，为基于软骨瘤免疫分型用于预测免疫状态和免疫治疗响应预测提供了重要的理论参考。
【参考文献】
Li B, et al. Fresh Tissue Multi-omics Profiling Reveals Immune Classification and Suggests Immunotherapy Candidates for Conventional Chondrosarcoma. Clin Cancer Res. 2021 .
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34426437/
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