nanopore测序数据质控

目前的nanopore测序质量一般，那么测序质量到底如何，则需要进行量化，也就是数据质控分析。数据质控是数据分析中非常重要的步奏，严格来说，数据分析中的每一步都需要进行数据质控，否则可能得到假阳性后者假阴性的结果，最终得到错误的结论。二代测序的数据质控目前已经非常成熟了，三代nanopore数据该如何进行质控呢，这次内容我们就来介绍一下

目前主流的R9.4芯片准确性在92%左右，下面是百迈克公司发布的一些nanopore测序数据的情况，我们看到当前nanopore测序平均Q值在7以上，Q7可以作为数据过滤的一个标准，平均长度可以在20K以上

目前用于nanopore测序数据质控的软件还是蛮多的

安装nanopack软件

虽然前面我们介绍过可以使用minion_qc处理sequencing_summary.txt文件进行绘图，但这是对结构化的统计表进行处理，而更常见的情况是需要对fastq文件进行处理。nanopack软件包可以用于nanopore数据的各种处理，里面包含了NanoComp，NanoFilt，NanoGUI，NanoLyse，NanoPlot，NanoStat等工具包，可以使用pip直接进行安装，一些工具也可以使用bioconda来安装，不过工具包中并不包括nanoQC，nanoQC需要单独安装。软件需要python 3以上版本，因为python的版本问题可能导致安装不成功，所以建议利用bioconda虚拟环境来进行安装使用。

命令行：

conda install -c bioconda nanoplot

另外由于这个nanoplot包是包含在nanopack里面的，所以如果要使用的话，需要进行激活nanoplot工具，即在conda的环境下激活Nanoplot

#激活nanopack
conda activate nanopack

image

激活之后可以明显看到Linux命令行前面的 (base) 切换成了现在的（nanopack）

使用NanoPlot对测序数据进行序列质控

NanoPlot --fastq ./output_hac/pass/all.fastq -o nanoplot/ -t8 --plots hex dot

生成的质控输出目录

image

下载NanoPlot-report.html文件

sz NanoPlot-report.html

结果预览：

结果预览 屏幕截图 2021-11-26 101809.png

结果解读：

首先看平均长度为300多，可能是多重PCR的数据，如果是正常的全基因组的测序数据肯定是比较低的。第二个是mean read quality有些低，如果不是用的fast模式或者或者老版本的guppy那可能的原因就是该该测序数据的质量不是特别好，一般来说现在的DNA质量都在13以上。

另外对于basecalling的过程，hac模式的质量值卡在9这个值，所以对于质控出来的reads如果quality值低于9一律被归为fail，这就导致basecalling出来的结果目录中既包含pass也包含fail目录

另外如果不考虑时间成本的话，也可以用super模式，得到的reads的准确度会更高

另外也可以用Qualimap进行质控

参考链接：https://wap.sciencenet.cn/blog-2970729-1070459.html?mobile=1

示例：

qualimap bamqc -bam ~/project/ONT/multi_sample_basecalling_gpu_sup/4_minimap_alignment/barcode01/alignment.sorted.bam  -oc