介绍
- 高通量测序数据的高级质控工具
- 输入FastQ，SAM，BAM文件，输出对测序数据评估的网页报告
安装
conda install fastqc
这里需要安装Conda (一款用于安装多数生物信息分析软件的管理软件，重要的是可以解决软件依赖) ： Conda 安装使用图文详解
使用
fastqc -t 12 -o out_path sample1_1.fq sample1_2.fq
-o --outdir:输出路径
--extract：结果文件解压缩
--noextract：结果文件压缩
-f --format:输入文件格式.支持bam,sam,fastq文件格式
-t --threads:线程数
-c --contaminants：制定污染序列。文件格式 name[tab]sequence
-a --adapters：指定接头序列。文件格式name[tab]sequence
-k --kmers：指定kmers长度（2-10bp,默认7bp）
-q --quiet： 安静模式
文档：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Help/
结果解读
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完全正常（绿），略有异常（橙） 或异常（红）
1. Basic Statistics （基础统计）
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2. Per base sequence quality
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- 这是 read length = 100 的scRNAseq数据，横轴为read位置，纵轴是quality。
- quality = -10*log10(p)，p为测错的概率。
- 根据quality给出质量结果：正常区间（28 - 40），警告区间（20-28），错误区间（0-20）。
- 比如，当read的某一位置的p=0.01,quality=20，那么它就处于错误区间。
3. Per tile sequence quality
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4. Per base quality scores
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- 横轴为quality，纵轴为reads计数。
- 当峰值处于quality为0-20时，报错。
5. Per sequence sequence content
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- 横轴为位置，纵轴为百分比
- 正常测序数据为频率相近的四种碱基，无位置差异。表现在图上的话，四条线应该是平行且接近。
- 当任意位置A/T与G/C相差大于10%报警告，大于20%报错
6. Per base GC content
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- 横轴为GC含量，纵轴为read计数。红色为实际测得，蓝色为理论分布。
- 如果曲线形状不符，代表文库污染
- 偏离大于15%，报警告；大于30%，报错
7. Per base N content
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- N 代表测序仪不能识别的碱基，横轴代表read位置，纵轴代表占比
- 如果正常测序，红线应该是趋近与0的直线
- 当任意位置N占比大于5%，报警告；大于20%，报错
8. Sequence Length Distribution
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- reads 长度不一致报警告；reads长度为0是报错
9. Sequence Duplication Levels
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- 横坐标为重复（duplication）的次数，纵坐标为reads的数目，以unique reads的总数作为100%
- 比如，当unique reads数大约为10%时，有两个重复；正常测序开始较高，后续趋近0%
10. Adapter Content
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- 横坐标为read位置，纵坐标为Adapter序列占比；如果fastqc默认参数会将所有的常见的Adapter都列出
- 正常情况是趋于0的直线，也就是说序列两端Adapter已经去除干净；如果有Adapter，需要先用cutadapt去接头
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