编者按
气道上皮细胞（AECs）是抵御外源抗原的第一道防线，外源抗原通过分泌生物活性介质来影响肺部的微环境，有助于将树突状细胞（DCs）等免疫细胞募集到发炎区域，从而刺激过敏性炎症。细胞间通讯对哮喘发病机理至关重要，并且主要由可溶性介体介导。外泌体是细胞间通讯中的重要角色。然而，气道上皮细胞（AECs）产生的外泌体是否参与哮喘的发展尚不清楚。
2021年4月上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸科研究团队在Journal of Allergy and Clinical Immunology杂志（IF=10.228）上发表题目为“Epithelial exosomal contactin-1 promotes monocyte-derived dendritic cells-dominant T cell responses in asthma”（点击“阅读原文”，即可下载原文）的研究成果，利用lable-free蛋白质组学技术及分子生物学手段揭示了外泌体蛋白CNTN1介导的哮喘发病新机制，该研究为治疗过敏性气道炎症提供了新的策略。中科新生命提供了外泌体label-free蛋白质组学技术服务。
【研究材料】
屋尘螨（HDM）刺激原代气道上皮细胞（pAECs）产生的外泌体；对照选用PBS处理的pAECs产生的外泌体
【组学方法】
Label-free蛋白质组学技术
研究方法
TEM和NTA分析AECs分泌的外泌体特征
分析AECs分泌的外泌体是否参与哮喘的免疫应答
探索AECs分泌的外泌体参与DCs促进哮喘的发展
验证CNTN1介导过敏性气道炎症并探索CNTN1的依赖性信号通路分子免疫应答
分析AECs分泌的外泌体是否参与哮喘的免疫应答
队列验证：CNTN1可作为哮喘患者的潜在生物标志物免疫应答
研究结果
一、HDM处理引发AECs分泌外泌体
作者首先使用透射电子显微镜扫描（TEM）和NTA分析确定HDM处理前后，AECs均具有生成外泌体的能力：囊泡直径范围为30至150 nm，且CD63和CD81（外泌体相关标记）染色呈阳性。作者进一步比较了HDM暴露与未暴露的小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中的外泌体。
结果表明，HDM处理的小鼠的BALF中，外泌体的数量增加，CD63和CD81的表达也明显高于对照组。上述结果表明，上皮细胞在正常生理状态下具有产生外泌体的能力，而在HDM刺激后将释放出更多的外泌体。
图1 气道上皮细胞来源的外泌体促进HDM诱导的过敏性哮喘
二、AECs分泌的外泌体参与HDM诱导的过敏性哮喘
为了确定AECs分泌的外泌体是否参与哮喘的免疫应答过程，作者先用磷脂酶抑制剂GW4869来阻断外泌体合成与释放，发现抑制外泌体分泌可以显著缓解哮喘症状（炎症反应降低）；之后用HDM-AECs EXO处理小鼠，发现外源HDM-AECs-EXO可以诱导并显著增强了2/17型免疫反应，导致肺中嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞过多。这说明源自AECs分泌的外泌体参与了HDM 诱发的哮喘反应。
三、AEC衍生的外泌体促进DCs的募集，增殖和活化
为了确定AECs来源的外泌体影响的细胞类型，作者在气管中施用了HDM-AECs-EXO。之后通过流式细胞术（FCM）测定肺细胞谱，发现DCs（树突状细胞）的百分比高于其它细胞。之后作者将PKH26标记的HDM-AECs-EXO施用于小鼠的肺部，发现50％的标记外泌体被肺DCs摄取。
作者进一步证实HDM-AECs-EXO处理会激活DCs的功能。这些结果表明，HDM-AECs-EXO暴露可促进DCs的募集，增殖和活化。作者用HDM-AECs-EXO刺激的DCs在敏化期移植到小鼠中，发现EXO-DCs促进过敏性气道炎症发生（处理后小鼠BALF细胞增多，嗜酸性细胞，血清炎症因子升高，支气管周炎症加重）。
图2 上皮细胞衍生的外泌体处理后肺中DCs积累
四、HDM-pAECs-EXO包含CNTN1蛋白
为确定外泌体中影响哮喘进程的关键成分，作者对PBS处理的pAECs（PBS-pAECs-EXO）和HDM处理的pAEC（HDM-pAECs-EXO）上清中的外泌体进行了Label Free蛋白质组学分析，分别鉴定到486和445个蛋白，27种蛋白在两组间差异较大。
随后作者发现在用HDM处理的pAECs或BEAS-2B细胞以及细胞上清外泌体中，CNTN1的表达均增加，免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）检测观察到HDM处理的小鼠肺组织中CNTN1同样增加。这暗示外泌体中的CNTN1可能是介导变应性哮喘中促炎作用的效应因子。
图3 HDM引发外泌体中的CNTN1蛋白含量增加
五、AECs-EXO中CNTN1蛋白促进过敏性气道炎症机制研究
通过腹腔注射CNTN1蛋白，作者发现CNTN1能够促进DCs在肺内的招募、分化和迁移。之后作者将HDM处理的BMDCs（联合或不联合CNTN1）通过鼻内移植WT小鼠。结果发现，HDM与CNTN1联合引发的BMDCs处理的小鼠肺炎性细胞因子水平升高，支气管周炎症增强，粘液产生增加。这些数据证实CNTN1引发的DCs促进哮喘的发展。
作者进一步发现在CNTN1暴露后，BMDCs中在mRNA和蛋白水平上Notch2的表达增加，Co-IP证实CNTN1和Notch2存在相互作用。作者使用Notch途径的阻断剂GSI，发现GSI可以逆转CNTN1诱导的过敏性炎症。这些结果证明CNTN1以Notch2信号传导依赖性方式诱导DCs活化，从而促进了过敏性气道炎症。
图4 CNTN1以Notch信号依赖方式诱导DCs激活，进而促进哮喘的发展
六、CNTN1可能作为哮喘患者的潜在生物标志物
接下来，作者使用健康对照者，哮喘患者（对HDM敏感）和ABPA哮喘患者的血液样本进行了队列研究。与健康对照组相比，哮喘或ABPA患者的血清IgE水平升高，对HDM过敏的哮喘患者的无外泌体血清和含外泌体血清中的CNTN1水平显著增加；数据分析发现哮喘患者的血清CNTN1浓度与IgE，呼气一氧化氮（FeNO）和鼻呼气一氧化氮（FnNO）呈正相关。这些发现表明CNTN1可作为哮喘患者的候选生物标志物。
图5 哮喘患者的CNTN1水平与气道炎症反应相关
总结
本研究首次揭示了AECs的外泌体在调节DCs引发的过敏反应中起关键作用，发现并证实AECs中的CNTN1蛋白通过Notch2信号通路诱导DCs活化，从而促进了哮喘进程。此外，哮喘患者的队列研究表明CNTN1可作为潜在的生物标志物。本研究揭示了外泌体在哮喘发病机制中的重要作用，也为过敏性气道炎症的临床治疗提供了新的策略。
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