流式之二 | 传统流式细胞术（分选型）

流式分选仪的发展趋势：检测通道与分选通道增加 & 自动化程度提升
分选型流式细胞仪与分析型相比增加了 分选系统，因此文内着重记录分选系统的原理和类型，以及细胞分选的应用领域，关于流式分析相关的介绍详细参考 流式之一 | 传统流式细胞术（分析型）

分选型流式细胞仪的发展历程（参考BD）

1. 流式细胞分选的原理

一台流式分选仪分为四大系统：（1）鞘液流和样本流构成的液流系统（2）激光器和滤光片构成的光学系统（3）信号检测器构成和呈现数据的电子系统（4）对特定细胞进行分选的分选系统

2. 流式分选的类型

2.1 捕获管分选

在封闭的液流管路上加装细胞分选系统，液流可分为三段：分析前区、细胞分析区和分析后区；在液流中安装一个可移动式捕捉管，捕捉管口可在“细胞分析区”和“分析后区”之间快速切换，捕捉管口处于“细胞分析区”时，可抓取欲分选细胞，捕捉管口处于“分析后区”，则不分选

• 优点：全封闭管路，有效防止污染
• 缺点：分选速度慢，且一次只能分选一种细胞

2.2 电荷式分选

在分选过程中，给予液流高频振荡（15-100kHz），使液流断裂为大小均匀的液滴，液滴在喷嘴下面与液流分离，瞬间加电，带正电荷或负电荷的液滴经过电场作用后会发生偏转，利用此原理就可以将感兴趣的细胞分选出来

• 优点：分选速度很快，且可同时分选出1-6种细胞
• 缺点：高压加电对细胞有微弱的损伤

电荷式流式分选仪-细节解剖

注意：
drop delay：激光激发到液流断点的时间
如果需要分选单细胞到96孔板或384孔板，在仪器自动计算drop delay基础上需要再通过手工的方法精准矫正

drop delay的理解

3. 分选模式的选择

• 富集模式：通常用于分选低比例细胞，保证得到足够数量的目的细胞，但是纯度会降低
• 纯度模式：最常用的模式，一个液滴里只有目的细胞，且没有非目的细胞，而且离这个目的细胞前后一定范围（才可以设定）没有目标细胞，它才被分选
• 单细胞模式：目的细胞必须位于液滴中间位置，前后液滴没有其他细胞才会被分选，一般用于多孔板克隆分选

分选模式的选择

流式分选（其他细胞分离方法不能替代的情况）：

• 目的细胞有极高的纯度要求（95%-100%）
• 分离低密度表面抗原的细胞（弱阳性细胞）
• 多色荧光标记来分选细胞
• 多孔板分选
• 极低含量的细胞分选（百万分之一）
• 根据表面受体密度差异来分离不同细胞

4. 细胞分选的应用领域

4.1 单细胞测序

流式细胞分选技术已是单细胞获取的主流技术：

• 高通量：短时间内分析大量细胞；高速分选，利于低比例细胞的快速富集
• 多参数：通过大小，颗粒度，内在或外在荧光染色，最大程度得获得单细胞的多维信息；将单个细胞的基因转录，蛋白表达和细胞功能三者有机结合，与上下游无缝衔接
• 操作可行性：技术成熟，流程适合进行标准化操作

举例：BD整体解决方案（细胞富集-->抗体孵育-->单细胞测序-->单细胞蛋白+基因表达分析）

流式分选仪获得的单细胞分选到384孔板进行CEL-seq，一次实验获得单个细胞的基因水平和蛋白水平的多重分析

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4.2 极低比例细胞（如CTC）

通过流式分选仪分选得到数量极低的CTC细胞，分置于384孔板可以分别用于下游的单细胞测序或qPCR检测

举例：BD CTC分析分选workflow

举例：食道癌病人PBMC中极低含量的CTC检测

举例：食道癌病人PBMC中极低含量的CTC检测

4.3 干细胞分选

目前，干细胞的研究几乎涉及生命科学和生物医药的所有领域，不仅在细胞治疗、基因治疗中显示出重要价值，还在基因功能分析、发育生物学研究、新药筛选等方面发挥重要作用。目前的研究热点聚焦于：

• 干细胞鉴定
• 筛选标志
• 诱导、分化机制
• 组织再生与修复

目前已经得到确认的适合FCM分析检测的肿瘤干细胞表面特异性标志物

依据细胞表面蛋白差异来分选细胞