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分子(DNA、RNA)样品的保存

分子(DNA、RNA)样品的保存

作者: Yizhe_Lin | 来源:发表于2022-06-23 19:30 被阅读0次

    本文将介绍DNA、RNA的保存策略,顺带提及细胞的保存方法。

    一、DNA的保存

    DNA为双螺旋结构,具有较高稳定性,但在野外样品采集的过程中仍需注意,以防降解。下面介绍以测序为目的的植物DNA采集与保存方法。

    (一)组织的采集

    通常采集用于测序的材料为当年生新鲜、幼嫩(近成熟)的健康组织,多以叶片为主,但当叶片难以获得时亦可采集植物的其它组织或器官(如芽、花、果实和种子等)。每份样品采集3-5g(鲜重),若为叶片可以表面积不小于50cm2计算(尺寸大小约等于成年人的手掌面积),每号DNA材料最好分为2份保存。可以将新鲜的植物DNA材料快速放入液氮(或带有冷藏功能的采集箱)中直至运输回实验室[1],回实验室后存于液氮或改用-80℃超低温保存,无需干燥,可长期保存(2年需行检查)。

    用液氮或采集箱保存的缺点是不利于野外作业,下面着重介绍干燥保存的方法[2]。将新鲜的植物DNA材料置于柔软且透气性较好的纸袋中进行干燥。透气的纸袋可以将植物DNA材料在干燥时与硅胶(干燥剂)分开,这样即便植物叶片因干燥变脆后,也不会在运输过程中被硅胶挤碎,不会与硅胶混杂,并造成样品间的交叉污染。如果没有类似的纸袋也可用塑料的自封袋替代,但植物DNA材料就需要与硅胶置于一起进行干燥。

    对于易失水的植物DNA材料(如纸质叶或幼嫩叶片等),应在野外采集DNA材料并立即进行快速干燥;对于不易失水的植物遗传物质材料(如革质叶或蜡质叶等),可在采集后放置一段时间(在叶片失水前),然后再进行干燥,但最好在采集后立刻干燥;对于难于用硅胶快速干燥的遗传物质材料(如较厚或具多浆的叶片或种子等),可将这些材料碎成小片(块)后用硅胶快速干燥。

    目前快速干燥植物DNA材料的最佳方式是硅胶(一种干燥剂),能够使植物材料在短时间内快速脱水,并且对DNA的损伤较小。有粉末状的白色硅胶(直径为20~30 Å)与变色硅胶(蓝色)两种类型可供选用,但混合使用效果更佳。粉末状硅胶能与组织紧密接触,加快干燥效率,变色硅胶则能显示出干燥的情况。通常变色硅胶是必要的,而粉末状硅胶可酌情使用。使用时应放入足够的硅胶(使硅胶覆盖全部的遗传物质材料)进行快速干燥。

    (二)组织的保存

    利用硅胶对植物组织干燥处理之中或之后,除野外采集过程,均需置于合适的环境当中。该环境的条件为温度(4-15℃)、湿度(相对湿度小于10%-30%),如果没有相应的保存条件,可在室温下保存,但一定保持在通风条件良好且干燥的环境下;植物DNA材料也可以在低温(-20℃)或超低温(-80℃)条件下保存,但需要保持DNA材料的干燥状态。尽管在这些条件下看似保险,但实际上植物DNA材料(如叶片等)很难长期保存,如在室温下保存超过2年的植物DNA材料其基因组DNA就会发生降解。因此另一种策略是保存总DNA。

    (三)总DNA的保存

    利用常规的方法(CTAB法、SDS法、试剂盒法等)提取材料总DNA,保存前需检查DNA的完整性、纯度、浓度和含量等。

    植物总DNA的保存最好以干粉状态保存,如果总DNA以溶液形式保存,则用1 × TE缓冲液稀释,且TE的缓冲液的pH值为8.0-8.5之间。植物总DNA低温保存最好在-80℃以下或液氮保存,无条件的也可在-20℃保存;总DNA应避免经常冻融;同时建议每份样品保存3-5个样本。总DNA提取后保存的时限通常较组织要长(>两年),但若长期保存,每隔两年应抽测,对不符合使用要求的DNA进行更新。

    二、RNA的保存

    RNA为单链分子,稳定性差,极易降解,降解的主要原因是内源性核酸酶(ribonuclease,RNAase)的作用,它在活体内的存在时间也不长。然而外源性RNA酶也不容忽略,头发、灰尘、体液、塑料等均有RNA酶的存在。因此RNA的保存需极其谨慎,提取时应该戴帽子、口罩、橡胶无菌手套,并在洁净、灰尘少的地方提取。从组织材料的采集开始,经运输与储存,包括实验的全过程,涉及到RNA的均需将其处于液氮[3],该温度下细胞生理生化过程近乎停止,方能较长时间保存。这意味着不仅组织材料需保存于液氮中,实验操作也需保证液氮充足供应。将样品保存于-80℃等均无法制止RNA的局部或完全降解。

    三、细胞的保存

    细胞是DNA、RNA的载体,细胞也构成了组织。当涉及专属的细胞学实验时,便需要特殊的方法对其保存,这往往是细胞工程的基础。例如做单细胞克隆,要求细胞具有活力。又如基于某些目的使用流式细胞术分析细胞,此时要确保细胞能够相互分离,通常要求细胞具有活性,糖在细胞内的累积会导致分析不准。液氮的低温环境(-196℃)是目前最佳的冷冻保存温度,复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当,一般生物样品在-196℃下可保存十年以上。应用-80℃保存细胞,短期内对细胞的活性无明显影响,但随着冻存时间延长,细胞存活率明显降低。

    不同层次的样品,需根据样品性质、实验目的、保存条件,综合分析,选择最适合的方法。目的样品是分子水平,就需从分子角度考虑组织的保存;细胞水平,则是从细胞角度考虑。不同层次对细胞的活性要求也不同。


    参考文献

    [1] 王珍,方宣钧.植物DNA分离[J].分子植物育种,2003(02):281-288.
    [2] 高连明,刘杰,蔡杰,等.关于植物DNA条形码研究技术规范[J].植物分类与资源学报,2012,34(06):592-606.
    [3] 张荻.百子莲花芽分化及开花机理研究[D].东北林业大学, 2011.


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    [1] RNA降解原理. Cas9X海星生物 - 搜狐.
    [2] 【科学普及】“最好细胞”的保存——浅谈细胞冻存. 政务:细胞世界 - 澎湃.

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