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用于潜在新的激酶靶点的初始药物
本研究提供的药物靶标矩阵的一个用例是为潜在的新靶标识别提供好的类药物特性的化合物。它们可以作为高价值的先导化合物，为药物研发项目提供信息或启动药物研发项目。
为了阐明这一概念，我们使用Kinobeads对来自相同患者的15例非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤和邻近健康组织进行了表达谱分析。重点考察在肿瘤中过表达的激酶，如著名的药物靶点EGFR和MAP2K1 (MEK1)以及激酶DDR1和MELK。并采用EGFR、DDR1和MELK染色组织微阵列(TMAs)对375例NSCLC患者进行回顾性生存分析。
鳞状细胞癌(SCC)和腺癌(ADC)病例的联合分析与EGFR和DDR1表达无显著相关性，对MELK的影响中等(log rank p= 0.04)。然而，对SCC和ADC的单独分析显示，MELK高表达与SCC患者生存不良的相关性更强，而与ADC患者生存不良的相关性不强(p= 0.02 vs p= 0.71)。这些结果证实了早期的报道，MELK是SCC-NSCLC预后不良的潜在预测指标。考虑到该差异表达模式和MELK的激酶属性，该蛋白可能在SCC-NSCLC亚型肺癌中成为一个可操作的靶点。
不过，MELK作为靶点的有效性存在一些争议，最近的细胞系研究表明，MELK蛋白通常不是癌细胞生长所必需的。因此，下一节讨论的数据并没有为MELK作为肿瘤学中的靶点提供验证，而仅仅是用来说明药物靶点交互筛选有可能用于临床前药物发现。
目前临床试验中唯一确认的MELK抑制剂是OTS-167 (I期)，该药物的Kinobeads谱分析表明，它是一种非常广泛的多激酶抑制剂，因此不太可能有助于MELK作为药物靶点的临床验证。此外，它对癌细胞的疗效可能并不源于对MELK的抑制。在我们目前的工作中还发现了另外16种MELK抑制剂(包括批准的药物Nintedanib和Sunitinib)，激酶活性测定证实了相当强的酶抑制作用。
为了深入了解MELK抑制剂的构效关系，我们将该蛋白与Nintedanib (PDB ＃5MAF)、K-252a (PDB ＃5M5A)、Defactinib (PDB ＃ 5MAH)、PF-3758309 (PDB ＃ 5MAG)和BI-847325 (PDB ＃ 5MAI)共结晶。这些不仅是第一个具有临床激酶抑制剂的MELK结构，分析还揭示了ATP囊内的10个氨基酸，这些氨基酸可能特别适合开发选择性和强效的MELK抑制剂。具体来说，Nintedanib参与了两种(E15，选择性残基和E57，效力残基)与其他结构未观察到的药物-蛋白相互作用。此外，该结构揭示了两个易于接近的半胱氨酸残基(C70, C89)，它们只存在于1%的人类激酶中，因此可以用于设计具有更高选择性的不可逆MELK抑制剂。
以上清楚地说明了如何利用临床化合物的系统分析数据，从概念上研究药物重新定位或药物化学。
重新利用Cabozantinib治疗FLT3阳性AML
BCR-ABL抑制剂伊马替尼也能有效抑制c-KIT和PDGFR突变，这一发现将该药物的应用从慢性粒细胞白血病扩展到胃肠道间质瘤(GIST)的治疗。它还表明，激酶抑制剂多重药理学可扩展化合物的适应症。
本研究提供的KI交互分析应该能够系统地提高发现药物适应症的机会。Kinobeads数据揭示，已知的MET/VEGFR抑制剂中，被批准用于治疗甲状腺髓样癌和晚期肾细胞癌的Cabozantinib 和Golvatinib还是酪氨酸激酶FLT3- ITD突变体的有效抑制剂，而后者常发现于急性髓系白血病(AML)的转移形式。而此前，并没有人发现Golvatinib对FLT3的抑制作用。两种化合物均能杀死FLT3- ITD依赖细胞，WB分析显示，两种化合物均能抑制FLT3的自磷酸化，从而显示了该靶点对细胞存活的贡献。
由于Cabozantinib是一种被批准的药物，我们进行了进一步的实验来评估它是否可以用于治疗FLT3-ITD依赖型AML。为此，使用Cabozantinib、FLT3抑制剂奎扎替尼和Crenolanib处理了一组AML细胞系。FLT3突变株(MV-4-11, MOLM-13, MONO-MAC-6)对上述三种药物均敏感，而FLT3- wt细胞(OCI-AML3,HL-60, KG-1a, THP-1)无应答。在含有FLT3-ITD突变的小鼠Ba/F3细胞中进行的其他实验显示，三种抑制剂对大多数突变体(但不是全部)都有很强的抑制作用。免疫荧光实验表明，FLT3-WT明显定位于细胞膜，而转染U-2 OS的FLT3-ITD K602R或FLT3-ITD E611C细胞主要定位于胞质中。Cabozantinib处理使细胞分布恢复到野生型蛋白。免疫印迹显示，低nM浓度的Cabozantinib也能抑制MV -4-11细胞中FLT3下游的STAT5磷酸化，从而表明该药物对AML细胞中异常FLT3- itd信号通路具有类似的抑制作用。
为评价Cabozantinib的体内疗效，MOLM-13 (FLT3-ITD;n= 6)或OCI-AML3 (FLT3-WT;n=5)肿瘤模型小鼠，用Cabozantinib处理。生物荧光检测显示，与未治疗组相比，注射FLT3突变细胞的治疗组小鼠的肿瘤负担在治疗后显著减轻。FLT3-WT异种移植物在药物治疗和载体治疗之间的肿瘤负荷无差异。为了监测存活率，在细胞注射后第14天停止给药，第26天处死最后一只动物。Cabozantinib显著降低了体内FLT3-ITD AML细胞的肿瘤生长，Kaplan-Meier分析显示，对药物治疗动物的生存有统计学意义的积极影响。
综上所述，该临床前数据和近期类似结果支持启动Cabozantinib在FLT3 - ITD分层AML患者中的II期临床试验。我们认为这是一种创新的方法，因为Cabozantinib和Quizartinib一样有效和特异，但比Midostaurin更有效、选择性更强，后者最近被批准用于AML治疗。
结论
这项工作提供了丰富的数据资源，描述了临床小分子激酶抑制剂及其靶点的分子景观。我们着重说明了为什么这些信息很重要以及如何使用这些信息。本报告的一个重要信息在于证明重新利用激酶药物是可行的，并且可以以系统的方式进行研究。为了促进数据的进一步开发，我们在ProteomicsDB中提供了更多的新功能，并准备为243种药物中的每一种提供目标摘要。此外，该数据可以通过特制的Shinyapp查询关于药物和感兴趣靶点的选择性和结合亲和力的具体信息。
我们致力于不断更新这个资源，并期望这一项目将改善我们对癌症药物MoA的理解，促进临床试验的设计创新，促进新化合物的开发，并帮助分子肿瘤的临床决策。
END.
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