NOTE 基于种群聚类,特有等位基因
基本概念
1 多态性条带
个人理解就是ssr引物1 在位点 扩增出的 a b 2个条带（2倍体），ab长度可能相同也可能不相同。如果a条带 在所有样本DNA中的长度一样，就不是多态性条带。如果有不相同就属于多态性条带？还是在学习中慢慢理解吧，不能单独去理解这一个问题花费很多时间。多态性条带应该是属于显性标记中的内容，文献中说ssr也有多态性片段概念
2 ISSR
下为ISSR 检测流程，ISSR 引物不分F R, 引物即是F 又是 R。ISSR引物可在dna 两条链中结合。需要某段序列两段具有 反向且互补的重复单位，这样单条引物可扩增到片段。这样需要反向且互补的重复单位间的这段序列尽量在样本间不显示差异。所以才说ISSR是显性，单个ISSR引物在样本中只能扩增出一条带（理论情况)，其实不是一条带，只要存在上述情况就可扩增
what-is-issr.png
3 TP-M13-SSR
参考文献为
Schuelke, Markus. "An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments." Nature biotechnology 18.2 (2000): 233-234.
image.png
对PCR原理还不是很清晰，画图了解以下，红色为M13序列，蓝色为F R引物， 橙色阴影部分表示引物与序列退火，QQQQ为目标序列，NNNN为非目标序列
3.1 首先 带有M13接头序列的正向引物和反向引物，对目标序列退火
M13F R
生成以下扩增产物
image.png
3.2 反向引物扩增带有M13接头序列的正向引物的序列获得
M13接头序列的正向引物和反向引物扩增产物
3.3 带有荧光基团的M13序列作为正向引物和剩余反向引物 扩增上步骤得到初步的扩增产物，最后由带有荧光基团的M13正向引物扩增得到的产物可由仪器可检测到
image.png
4 聚丙烯酰胺 电泳图
看文献，聚丙烯酰胺 电泳图中SSR引物有很多条带，怎么判断哪些是 产物条带？，下面这个文献中的电泳图是属于与荧光检测保持一致的，即纯合位点为一条带，杂合位点2条带。
聚丙烯酰胺 电泳图，参考：利用荧光SSR 分析中国糜子的遗传多样性和群体遗传结构
5 遗传多样性参数
5.1 观测杂合度 (Ho)； Observed Heterozygosity (Codom Data)
杂合个体数与样本数的比值
Ho
5.2 期望杂合度（He） Expected heterozygosity (Codom Data)
1减去所有等位基因频率平方和，但不明白此参数能表明什么，
He
5.3 Fixation Index （F）(Codom Data)，
F 趋近0 说明位点under 随机杂交，符合哈温平衡？大量正值表明 近亲杂交（inbreeding）
GenAlex中的F
5.4 有效等位基因数
理想种群下的
Ne
5.5 基因流 Nm
Nm
流程
1 引物获取 筛选
从转录组或基因组数据中获得批量SSR引物，也可从以往论文中选取引物，进行引物筛选。引物设计使用 oligo7 或 primer 等。oligo是免费的，primer 需付费使用。
筛选引物可通过琼脂糖，聚丙烯酰胺，毛细管电泳检测引物扩增效果，最后筛选到特异性较强的引物进行基因组扩增。
20200901 数据全部完成
2 数据分析
本次实验采用 荧光 毛细管电泳。以软件的使用作为实验内容。软件的具体用法见文集中的软件使用说明，其实手册已经写的很详细了。
最终数据结果如下，会得到具体片段长度的大小
毛细管电泳结果
2.1 分析遗传多样性参数
共24个位置无数据
使用GenAlex分析遗传多样性参数，但是不太明白这些参数的含义，还担心在计算的过程中会遗漏数据，就跑2次，看下结果一样不
分不同地区比较不同种源的遗传多样性指数差异。目前以省划分最低分类
杂合度低 与 自花授粉有关？
2.2 计算PIC
GenAlex无法计算PIC，使用Powermarker
2.3 进化树分析
Powermarker计算遗传距离，UPGMA或NJ 法建树
DARwin 也有文章 使用这个软件 ，很多文章使用 DARwin吗，Powermarker 比较简单
得到树文件，使用itol美化。统计每个亚群下的种群个数。
2.4 PCA 分析
GenAlEx 中有此功能
2.5 AMOVA 分析
variance components of the populations， 即种群遗传分化
可根据地区，聚类，structure 的种群分类来做此分析， 并比较不同分类下的遗传差异，种群内外变异差异。
（1）GenAlex中AMOVA分析需要确定以下参数
AMOVA参数
对于共显性数据有以下三个选项，其中Codom - Microsat适合SSR数据，不知道选择哪个选项。
image.png
（2）其他参数
也不太清楚每个参数的含义，就先选择默认参数
image.png
(3) 结果
会得到类似以下的结果
文献中amova结果
聚类 与 structure 之间的某些种群用venn 图表示共有样本
GenAlEx 可用，
2.4 种群structure 分析
每个种群中个体根据 probability score 划分为 pure 或admixture，单独划为一个subgroup?
根据第一次划分的种群，可以继续划分sub-sub group
（1） 使用Structure Harvester获得最佳k
（2）Clumpp 重复抽样从多个run获得结果
(3) distruct 画图
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