DNA甲基化检测技术介绍

DNA甲基化是重要的表观遗传修饰之一，是指在DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase，DMT）的催化下，以 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，讲甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA 甲基化修饰在调控基因表达、维持染色质结构、基因印记以及胚胎发育等生物学过程中发挥重要作用。常见的DNA 甲基化形式主要有5-甲基胞嘧啶（5mC）、4-甲基胞嘧啶（4mC）和6-甲基腺嘌呤（6mA）。在真核生物中，胞嘧啶5位碳原子处常发生多种不同的碱基修饰，除在植物、动物和真菌中分布最为广泛的5mC 外，还有5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-醛基胞嘧啶（5fC）以及5-羧基胞嘧啶（5coC），这些DNA的甲基化从多个角度参与调控基因表达。相比之下，在原核生物中，6mA是最为常见的碱基修饰形式，参与多种重要生物学过程中，包括甲基化依赖型错配修复以及转录调节等。

DNA甲基化检测技术原理差异

目前有多种方法可以检测DNA甲基化。其中全基因组重亚硫酸氢盐测序法（Whole-genome bisulfite sequencing，WGBS）是前期检测DNA甲基化的主要方法，是将重亚硫酸盐处理方法和Mluchina Hiseq 高通量测序平台相结合，对有参考基因组的物种进行全基因组水平的甲基化研究。该方法中，重亚硫酸盐可以使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶（C）脱氨基转变成尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶保持不变，随后通过PCR扩增目的片段，尿嘧啶（U）可转化为胸腺嘧啶（A），最后通过对POR产物进行测序即可判断发生甲基化的位点。另外包括简化重亚硫酸氢盐测序RBS和850K甲基化芯片，也是采用重亚硫酸盐处理的方法。该方法也存在一些缺陷：（1）此方法只能检测5mC或4mC，不能检测6mA：（2）重亚硫酸盐的处理会导致大量DNA 片段化，影响扩增；（3）将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，增加了文库制备的复杂性，转化的不完全也会造成结果偏差；（4）无法有效区分5mC和5hmC。

另外，DNA甲基化免疫共沉淀测序（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing，MeDIP-Seq）测序是基于抗体富集原理进行测序的全基因组甲基化检测技术，采用甲基化 DNA 免疫共沉淀技术，通过5-甲基胞嘧啶抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段，然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。前期的DNA甲基化技术，单一技术无法全面覆盖所有甲基化类型，同时由于需要 PCR 扩增，外加 IIumina 测序读长短，也会导致扩增偏好性而一些区域难以覆盖。

随着测序技术的发展，单分子测序技术如 Pacbio 测序和Nanopore测序，基于其各自的信号读取方式，二者均可以直接检测DNA的碱基修饰情况，不需要PCR扩增和重亚硫酸盐处理，这也将为表观遗传研究带来更准确和丰富的信息。