11月16日，北京安贞医院张宏家和何怡华教授课题组在期刊《Frontiers in Genetics》上发表了题为“Case Report: Characterization of a Novel NONO Intronic Mutation in a Fetus With X-Linked Syndromic Mental Retardation-34”的研究论文。该研究扩大了NONO的突变谱，进一步发现左心发育不良综合征的是NONO相关疾病的表型，该研究强调了在对外显子测序数据中对内含子区域分析的重要性，也指出功能研究可以成为鉴定突变致病性的有力工具。该研究的进一步工作也将有希望阐明NONO基因功能障碍与心脏异常表型之间的病理生理机制。
一、 背景介绍
含有non-POU结构域的八聚体结合基因NONO位于Xq13.1染色体上，其结构在果蝇和人类中都高度保守，目前已报道的功能包括参与RNA合成、转录调控和DNA修复。有报道称NONO的半合子突变在一些男性患者中会导致x连锁的智力发育迟缓综合征34(MRXS34;OMIM: 300967)。主要表现为x连锁隐性遗传，表现为脑部发育不良的表型。除此之外，部分患者也出现了包括左心室非压实性心肌病(LVNC)和先天性心脏病(CHD)等心脏表型。但由于缺乏临床报道，一些临床表型和NONO基因突变相关疾病还没办法联系起来。但本研究在一个患有左心室发育不良综合征胎儿基因组中鉴定了NONO基因携带一种新的内含子变异。这个病例扩展了NONO的突变谱，并且通过与之前报道过的NONO突变患者的心脏表型进行综合研究，说明了LVNC和CHD都是MRXS34心脏表型的特征。
二、材料方法
研究者对患病胎儿进行完整的胎儿超声心动图检查，发现胎儿心脏发育不良，之后对已故胎儿及其父母基因组DNA进行了全外显子组测序和拷贝数变异检测，测序数据与人参考基因组(hg19/GRCh37)比对，首先使用Picard v1.57去冗余、用GATK进行变异检测、用ANNOVAR进行变异注释。然后用SIFT、polyphen、MutationTaster和CADD预测错义突变的致病性，用SpliceAI、HSF和MatEntScan 评估突变对可变剪接的影响。最后过滤掉预测为不有害的错义突变，以及可变剪切评估不有害的内含子突变，最终鉴定到X染色体上NONO基因的突变。研究者之后还进行了体外微型基因剪接实验，以证明NONO的内含子变异导致的有害效应符合预期。
三、研究结果
（一）临床表型
产妇年龄28岁，与配偶都很健康，双方没有血缘关系，也明显的家族遗传史，也没有在孕期服用任何药物。在孕26周时进行产前超声心动图检查，详细的胎儿超声心动图检查发现胎儿左心室发育不良、二尖瓣发育不良和主动脉发育不良(图1)，这与产前超声诊断一致。但产妇在早期和中期妊娠的超声检查未发现心脏外异常。经过多方面的咨询和建议，这对夫妇决定终止妊娠并进行基因检测，但拒绝对胎儿进行尸检。
图1 胎儿超声心动图证实主动脉发育不全（图片引自文献[1]）
（二）分子水平检测
对从胎儿和父母样本中提取的DNA进行拷贝数变异测序和全外显子组测序，以确定胎儿心脏表型的潜在遗传因素。拷贝数变异测序未发现染色体异常。全外显子组测序在靶标区平均测序深度为105x，覆盖率达到96.21% 。通过比对，总共鉴定到了 81,885个变异位点。最后，研究者在NONO基因(NM_001145408.1)的内含子4中鉴定出了一个由母亲遗传的半合子突变体c.154 + 9A > G。二代测序数据显示，这个变异位点在先证者当中野生型和突变型的比例为93:0，在母亲和父亲比例分别为96:73和0:61。随后的Sanger测序证实了母亲在该基因位点存在杂合突变(图2)。
图2 Sanger测序显示，该突变在母体中是杂合的（图片引自文献[1]）
（三）剪接分析模型
使用SpliceAI、HSF和MatEntScan进行剪接预测，内含子c.154 + 9A > G变异可能通过不同程度的影响剪接位点并利用隐性剪接位点来影响剪接过程。HSF预测发现该基因突变体是成熟mRNA中插入了内含子4中的4个碱基(图3)。这种变体会导致移码突变和提前终止。
图3 预测结果示意图显示c.154 + 9A > G变异导致其剪接异常，星号表示c.154 + 9A > G变异的位置（图片引自文献[1]）
（四）微基因剪接分析结果
为了证明c.154 + 9A > G突变是由4 个碱基的插入导致，研究者进行了微基因剪接实验。RT-PCR分析和Sanger测序都证实c.154 + 9A > G的cDNA片段在内含子4到外显子4之间多了4个bp (c.154_155ins GTGT)(图4)。这一结果与模拟分析结果一致。
图4 微基因构建产物测序结果（图片引自文献[1]）
四、总结
这项研究发现了患有HLHS的胎儿携带一个含有新的内含子变异的NONO基因。微基因实验表明，该变异导致了一个隐性剪接位点的激活，在成熟mRNA中插入4个碱基。本研究扩大了NONO的突变谱，并将左心发育不良综合征扩展为NONO相关疾病的表型。
参考文献：
1. Hairui Sun, Lu Han, Xiaoshan Zhang et al. Case Report: Characterization of a Novel NONO Intronic Mutation in a Fetus With X-Linked Syndromic Mental Retardation-34[J]. Frontiers in Genetics, 2020.
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