Temporal expression of MOF acetyltransferase primes transcription factor networks for erythroid fate

文章信息

今天介绍的文献于2020年5月20日发表在Science Advances上，文章题目是： Temporal expression of MOF acetyltransferase primes transcription factor networks for erythroid fate（MOF乙酰基转移酶的时空表达启动转录因子网络调控红系命运）

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摘要

造血干细胞（HSCs）的自我更新和分化受转录因子和表观遗传调节因子的精细调控。这里，作者探索了组蛋白H4赖氨酸16乙酰转移酶MOF调节红细胞生成的机制。单细胞RNA测序和染色质免疫沉淀测序发现MOF通过动态募集染色质来影响红系发育轨迹，其单倍剂量不足会导致短期的HSC细胞群积聚。由MOF，RUNX1和GFI1B组成的调控网络对于红系命运至关重要。GFI1B充当Mof激活剂，它的表达对于特异性细胞诱导Mof表达是必需和定量的。Mof耗尽HSCs的可塑性可以通过下游效应Gata1的表达或通过组蛋白去乙酰基酶抑制剂的重塑乙酰化平衡来挽救。Mof表达的准确时机和剂量可充当前馈转录因子网络的变阻剂，从而保证沿红系命运的发展。

样本数据

已发表数据：

published transcriptome-wide data（18）

Chromatin accessibility analysis from human hematopoietic cells (ATAC-seq)(27)

bulk (37) and single-cell ATAC-seq (scATAC-seq) of hematopoietic cells (38).

published GFI1B ChIP-seq profiles (40).

此研究产生数据：

Mouse strains：Eight- to 12-week-old mice from both sexes were randomly allocated to experimental groups. Ten-week-old male animals were used for ChIP-seq, RNA-seq, and scRNA-seq

Cell culture：HPC7 (murine hematopoietic progenitor cell line CVCL_RB19)， K562 cells (human blood from chronic myelogenous leukemia CVCL_004) and Wehi-3 (Mus musculus monocytic leukemia, CVCL_3622) cells

scRNA-seq experiments on FACS（Fluorescence-activated cell sorting）-sorted progenitor cells

Bulk experiment

ATAC-see (26)

ChIP-seq profiles from primary HSCs (15,000 cells; LSK+CD34−Flt3−) and MEPs (30,000 cells)

数据分析

fate-bias probabilities from c-Kit+ cells [data from (12) https://github.com/AllonKleinLab/PBA

RaceID3 （https://github.com/dgrun/RaceID3_StemID2） （25）

FateID （25）

StemID2 （https://github.com/dgrun/RaceID3_StemID2）

TRAP (33)

pseudotime analysis STREAM (39)

Monocle （61）

fate bias （25）

STREAM （39）

分析结果以及实验验证

红系中的非特异性致死化合物

​ 组蛋白乙酰化是由KATS和组蛋白去乙酰酶（HDACs）控制，其中，一个超乙酰状态通常会导致染色质解体 (16, 17)。为了调查哪些KATS和HDACs可能被红系生成过程中观察到的动态表达基因调控，作者分析了已发表的转录组数据(18)。大多数酶（例如Tip60，Ep300或Sirt1）在整个类红细胞轨迹中都稳定表达，但作者观察到Mof表达是动态的（图1A）。作者还评估了c-Kit +细胞的红系，髓系和淋巴的命运偏向概率[数据来自 (12)，与Mof表达有关（图S1，A和B）]。与已知的红细胞标记（例如Gata1，Kfl1，Gypa，Hbaa1和Alas2）相似，表达Mof的细胞与红系或淋巴细胞相比，沿红系谱系发展的倾向更高（图1B）。

图1 ABCD

接下来，作者们要确定Mof的丧失是否会影响红细胞生成。然而构建Mof的基因敲除（KO）小鼠模型具有胚胎致死性（19），但Mof杂合子（Mof +/-）小鼠是可行的，并且没有表现出明显的表型或寿命改变。杂合动物的造血祖细胞显示Mof 的mRNA降低60％（图S1C），MOF蛋白大量（图S1D）和H4K16ac水平降低（图S1E）。作者发现Mof +/-小鼠显示出低的RBC和血红蛋白（HB）以及血细胞比容（HCT）水平（图1C），所以将它判定为贫血。为了查明有缺陷血液形成的起源，作者们对Mof +/-小鼠（图S2和注释S1）的骨髓（BM）的细胞库进行了广泛表征，并使用条件性Vav1- iCre Mof-KO模型独立验证了表型（图S3，A至F和注释S1）（20）。Mof +/-动物显示出红系祖细胞和MEP的显著减少（图S2B），同时髓系祖细胞的数量增加（图S2B）。这些小鼠还会积聚具有形态缺陷的RBCs，并且网织红细胞的百分比增加（图S2，C至F）。然而，这些变化并没有伴随BM总细胞数和在- c-Kit+细胞的血数量上表现任何显著差异。此外，作者也没有观察到脾脏质量和/或细胞性的任何重大变化，以及红系细胞中细胞凋亡频率或细胞周期异常的差异。然而，红系细胞明显减少，并且作者检测到外周嗜中性粒细胞数量增加（图S2，G至M）。总体而言，这些分析表明Mof含量的降低会导致红系发育受损，并伴有髓样倾斜。

MOF存在在两种不同的染色质修饰复合物中，即非特异性致死（NSL；哺乳动物中为KANSL）复合物和雄性特异性致死（MSL）复合物。在哺乳动物中的MSL复合物，MOF参与了发育基因的精细调调控（21，22）。但是，在MSL3中具有功能丧失突变的人类个体未显示血细胞缺陷（21）。因此，作者怀疑MOF作为KANSL复合体的一部分在红细胞生成过程中发挥其功能（23）。作者生成了条件性的Kansl2和Kansl3 KO小鼠在删除Vav1-iCre基础上，并表征了它们的血液成分（有关详细信息，请参见注释S1和图S3，G至O）。两种突变体均显示出类红系细胞发育的缺陷。Vav1- iCre / Kansl2 KO小鼠与Mof +/-小鼠更相似，因为它们也具有正常的寿命，但在体内（图S3，H和I）和体外（图 S3，J和K））的红系祖细胞和RBC明显减少。此外，亚致死量照射的野生型小鼠接受200 VAV1 -iCre / Kansl2 KO HSCs的过继转移（LSK + CD34 -的Flt3 - CD48 + CD150 +）也显示受损的红细胞生成（图S3L）。相反，Vav1- iCre /Kansl3 KO触发了更强的表型，其特征是胚胎致死和胎儿肝脏红系祖细胞的丧失，特别是在晚期红系分化中（图S3，M至O）。与Mof相反，Kansl2和Kansl3条件性KOs并未显示粒细胞增加（图S3I），这意味着在Mof +/-动物中发现的髓样偏见可能源于KANSL独立功能。

图1 EGHF

基于Mof沿红系分支的两个表达峰（图1A），作者有兴趣进一步探讨贫血表型是否由HSCs，祖细胞和/或定型细胞中的功能引起。作者首先测试了Mof丢失是否会影响HSC参与红系谱系的内在能力。作者们将来自野生型或Mof +/-小鼠的单个HSCs分类到液体培养孔中，其中含有支持髓样，红系和淋巴样分化、单细胞集落形成单位（sc-CFU）的细胞因子。作者通过荧光激活细胞分选（FACS）检测了219个单克隆输出（72个野生型和147个Mof +/-），以检测髓样（c-Kit − CD11b +），红系（c-Kit − Ter119 +）和淋巴样分化[c-Kit − IgD + ; B细胞群体，因为这些条件缺乏T细胞引发所需的细胞间相互作用（24）]。培养10天后，作者没有观察到集落强度的差异，因为野生型和Mof +/- HSCs均可产生多能（全部三个种群），双能（两个种群）和寡聚（仅一个种群）集落，每个集落大小和总细胞数相似（图1，D和E）。但是，作者发现产生细胞偏斜，其中Mof +/- HSCs产生明显更多的髓样细胞和较少的红系细胞，而B细胞数量保持不变（图1F）。为了进一步验证这些HSCs的增殖和分化能力，作者进行了bulk CFU分析，其中将100来自野生型或Mof +/-小鼠的FACS分选的HSCs接种在补充细胞因子/生长因子的甲基纤维素基培养基中,它维持两种类型的红系祖细胞[爆发形成单位红系（BFU-E）和CFU-E]，粒细胞和/或巨噬细胞（GM）祖细胞（CFU-GM）以及粒细胞，红细胞，单核细胞，和巨核细胞集落（CFU-GEMM）。与sc-CFU分析中获得的结果一致（图1，D和E），作者在bulk CFU实验中观察到Mof +/- HSCs中BFU-E数量减少，CFU-GM数量增加（图1G）。

由于杂合动物中Mof的终生耗竭可能会引起继发效应或导致第二反应其可能混淆作者分析细胞表面标志物表达变化，因此作者使用诱导型小鼠模型（Cag-CreERT2 T / + ; Mof fl / fl）验证结论，其中仅在培养物中进行4-羟基他莫昔芬（4-OHT）处理后才删除Mof（称为Mof -iKO）。在HSCs中诱导通过4-OHT处理Mof KO导致髓样菌落数量增加而红系集落数量减少（图1H），概括了Mof +/- HSCs中观察到的表型。作者观察到Mof +/- HSCs在CFU-GEMM中显示出明显的减少，而在Mof -iKO小鼠中却没有那么明显，表明这可能是次要的作用。接下来，作者从Mof +/-和Mof -iKO HSCs进行了连续培养CFU分析。该分析表明，尽管Mof +/- HSCs在重培养后仍保持对髓样命运的偏向，但Mof -iKO HSCs形成的总体菌落明显少于对照（图1I），这表明Mof KO完全破坏了HSC的自我更新能力。

图1 IJK

考虑到Mof +/-小鼠不仅显示出早期红系分化的缺陷，而且还显示出受损的晚期红系分化的迹象（图S2，C至I和注释S1），与晚期相比，作者研究了HSCs中Mof降低的后果。为此，作者首先对来自野生型和MOF +/-动物中MEPs的进行CFU分析试验（Lin−cKithighSca-1−CD34−FcγgII/III−），评价在培养中他们的集落形成的能力。

来自Mof +/-动物的MEP（分化过程中MOF长期发生变化）显示出CFU-E和BFU-E集落（来自Mof +/- MEPs）明显减少（图1J）。为了了解Mof缺失在已定型的红系细胞/巨核细胞祖细胞中的后果，作者们对MEP进行分选，并在分选后并进行体外4-OHT处理然后分析CFU细胞。当作者们使用Mof-iKO模型时，获得了不同的结果，在该模型中，已经启动的祖细胞（MEPs）中的Mof既不影响CFU-E也不影响BFU-E的形成（图1K）。这些数据支持“Mof的功能在红细胞生成的早期阶段和观察到的终末分化很重要”的想法。

为了分析体内HSC谱系启动，作者进行了Mof +/- HSCs的移植。移植后八周，作者观察到脾脏大小明显增加（图S4A），尽管作者未观察到细胞死亡的总体差异，但注意到明显的粒细胞失衡，其特征是淋巴样数量减少且髓样细胞数量增加（图S4，B和C）。与野生型受体脾相反，Mof +/-受体脾未能恢复其组织结构，其中作者观察到了毛囊结构缺陷和红系细胞的总体减少（图S4D）。此外，根据其Mof +/-基因型，移植的细胞（CD45.2 +）显示出H4K16ac水平降低（图S4E）。Mof +/-受体小鼠表现出脾脏红系祖细胞的频率降低，而循环成熟RBC显着降低（图S4，F和G）。总的来说，这些数据表明脾脏肿块的增加可能反映了髓样的扩张。

接下来，作者检查到Mof +/-受体动物BM 中CD45.2 +细胞严重减少（图S4H）。HSPCs中的进一步聚集显示常驻HSCs数量增加，MPPs减少（图S4，I和J）。为了探索HSC的自我更新和分化能力，作者接下来进行了BM二次移植。Mof + /-第二受体由于严重贫血而过早死亡（图S4，K和L）。该结果还表明，在重复性挑战下Mof +/- HSC可能会损害自我更新，如在CFU系列培养实验中针对Mof -iKO所述（图1I）。

这些数据一起表明，Mof的一个等位基因的丧失会以细胞内在的方式干扰HSC谱系定型，而优先选择粒细胞/髓系谱系，而以牺牲红系谱系为代价。此外，作者发现谱系定型后删除Mof，即在MEP中，不会导致红系集落形成缺陷。

Mof +/-动物中由于扰动的红系程序而导致转移状态祖细胞的积累

为了理解体内受损红系谱系定型，作者利用FACS从野生型和MOF + / -小鼠的祖细胞分选进行scRNA-SEQ实验[792 LT-HSC，576 LSKhighCD34 -Flt3 -，864 LSKhigh， 576 LSK low ，768 cKit high，48个巨核细胞祖细胞，24个粒细胞/巨噬细胞祖细胞（pre-GMP），24个粒细胞/巨噬细胞祖细胞（GMP），48个pre-Meg-E，48个pre-CFU-E，48个MEP ，以及24 Pro-E]（图S5，A和B，请参见材料和方法）。使用活性染料来确保仅对活细胞进行了分选。应用了RaceID（25）根据基因表达生成聚类（图S5，C和D），并使用各种方法（包括已知标记基因的表达和转录组熵）验证聚类图（图2，A至C和图S5，E和F）。作者观察到Mof +/-红系中红系程序的明显失调，例如在MEP（cluster 6） 中的 Gata2，Hbb-bt，Hba-a1，Trib2，Aqp1和在红细胞中的Mpo，Car-1，Car-2，和Hba-a1（cluster 3）图2D）。

图2 AB 图2 CD

接下来，作者使用FateID探索细胞命运如何在Mof +/-细胞中受到干扰以及如何形成命运偏向（图2E和图S5，G和H）（25）。这些分析证实，与表达其他KAT的细胞相比，表达Mof的细胞具有更高的的可能性成为红系细胞（图S5G）。接下来，作者定义了两个不同的轨迹终点（GMP，cluster 8；红系细胞，cluster 3），并提取了其他祖细胞群中所有细胞或dHSC分化为这两个终点的概率。这表明与GMP谱系相比，Mof +/-细胞遵循红系谱系的可能性要低得多（图2E和图S5H）。与较低的红系细胞分化的预测一致，作者观察到Mof +/-小鼠的BM中红系细胞数量减少（图2F），尽管观察到这些动物的BM细胞没有明显变化（图S2B）。红系细胞的减少与细胞凋亡增加或增殖减少无关（图S5I）。但是，这与有缺陷的红系细胞程序一致，因为作者观察到分选的MEP中Gata1-Pu.1平衡发生了变化（图S5J），因此验证了作者的scRNA-seq结果。

图2 FG

作者根据基因型进行t-SNE图进行聚类，并在dHSCs（cluster 2）和MPPs（cluster 4）中检测到野生型的细胞多于Mof +/-型细胞，而在其他情况下Mof* +/-细胞多于野生型细胞（cluster 10）（图2G并注意S2）。作者通过FACS证实了这一点，观察到HSCs升高，但Mof +/- BM中MPP2（图S6A）的数量显着减少，而细胞死亡数没有改变（HSC到MPP4），活性氧（ROS）的产生（ HSCs）或细胞周期（LSK +）没有变化（图S6，B至D）。考虑到Mof +/- HSCs不易形成红系细胞集落（图1，E和H），作者怀疑cluster 10 中积累的细胞可能是分化受损的结果。

作者对此细胞群感兴趣，更广泛地描述了其特征（图S6，E至L和注S2）。检测到典型的dHSC表达模式，例如Myc和Tal1网络的调节减少，Erg和Hoxa9网络激活，以及与各自的分子重叠强相关性[ MoLO基因（11）]和高视黄酸模式。cluster 10还同时显示了aHSC的特征，例如Meis1，Cdk4，Cdk6和活跃的Stat1途径的表达。考虑到主动功能和dHSC功能的呈现，作者假设Mof+/- HSC代表中间HSC状态。总之，分析表明，正确执行红系分化程序需要祖细胞中MOF作用。

红系生成过程中MOF介导的染色质可及性动力学

接下来，作者试图研究MOF调控红系程序的分子机制。由于MOF会沉积H4K16ac，在体外这直接影响染色质可及性（15），因此作者使用可视化的转座酶可及染色质（ATAC-see）分析研究了沿红系生成的染色质紧缩。简而言之，该方法允许通过转座酶辅助原位成像以单细胞分辨率可视化可及基因组（26）。作者通过FACS和显微镜分析了ATAC-see信号（图3，A和B）（图3C和图。S7，A和B）。总体而言，这些数据表明Mof +/-动物在HSCs（LSK + CD34 - CD150 +），MPP（LSK + CD34 +）和MEP（Lin - Sca-1 - cKit高CD34 - FcgRII ）中显示出总染色质可及性的显著降低。/ III - ），而不是的GMPs（林-的Sca-1 -的cKit高CD34 - FcgRII / III高），它支持细胞类型特异性功能。

图3 ABC

作者的ATAC-see数据揭示了野生型细胞中沿红系分化过程的染色质可及性的全局变化。当作者重新分析来自（27）已发布的人类ATAC-seq数据时，作者也注意到，HSC和MEP的可及区域数量比MPP和红系细胞（图3D）高。与此相符，作者在他们的数据中发现HSC，MEP和MPP2中H4K16ac的水平显着增加（图3E和 fig. S7C）。总的来说，这些数据表明H4K16ac和体内整体染色质可及性之间存在直接联系。

图3 DEF

因此作者询问Mof本身的表达变化是否反映了染色质可及性的这种动态模式。为此，作者对HSCs进行了分类，并进行了CFU分析，并在第0天（细胞分选后），5天和10天收集了RNA。作者观察到野生型细胞中Mof RNA的水平遵循与已发表的和作者自己的体内全基因组数据相同的动态模式（Figs. 3F and and1A and fig. S9A)。与野生型细胞相比，源自Mof +/- HSC的集落特征是最初的Mof水平较低，随后在5天时异常增加Mof RNA，然后在基于甲基纤维素的培养基中10天后再次降低（图3F）。Mof RNA的这些波动反映体内染色质可及性和H4K16ac的动力学，作者在Mof +/-共同髓样祖细胞（CMPs）中通过ATAC-see观察到的染色质可及性峰值和较高的H4K16ac水平(Figs. 3, B and E）。这些数据表明，红系生成缺陷不仅出现在Mof表达缺失下，还受其表达时间干扰[例e.g., Mof+/− mice]。为了验证这些变化是由MOF的细胞内在功能引起的，作者在Mof- iKO HSC中重复进行了ATAC-see[Fig. 3, G and H)]），该结果概括了Mof +/-小鼠中的早期结论。一起表明沿红系生成的全面染色质可及性动力学是由MOF介导的H4K16ac沉积决定的。

fig3 GH

HSCs和MEPs中不同的MOF全基因组结合谱

为了评估MOF如何指导造血谱系承诺，作者接下来从野生型和Mof +/-动物型分离了原代HSCs（15,000个细胞; LSK + CD34 − Flt3 −）和MEP（30,000个细胞）产生ChIP-seq谱（图 S8A）。经过质量控制评估（FastQC）之后，作者找出了peaks并在HSCs中确定了20,096个MOF结合区域（请参见补充数据）和在MEPs中确定了25,521个MOF结合区域（请参见补充数据），其中分别有16,924和6817结合在转录起始位点（TSS）附近[图4A和图。S8，B和C；也参见（29，30）]。作者不仅观察到动态结合（cluster 1，HSC> MEP；cluster 2，HSC <MEP），而且观察到细胞类型不变的峰（cluster 3；图4B）。验证作者找出peak的特异性，MOF ChIP-seq信号在Mof +/- HSC中整体降低，但是这种效应在细胞类型特cluster 1中最为明显（图S8，D和E）。作为补充数据集，作者在造血前体细胞7（HPC7）中生成了MOF和H4K16ac ChIP-seq图谱。这些数据与HSC数据高度吻合，并进一步证实了MOF和H4K16ac在特定于细胞类型的靶位点上的特定重叠，而其他KATs [e.g., p300 data from (31)]不存在（图4C）。

图4 ABC

为了验证MOF结合区域是否受到影响，作者评估了它们在scRNA-seq数据集中的表达。与MOF介导的组蛋白乙酰化的激活作用一致，作者观察到的MOF-结合基因的RNA水平，但不是随机对照基因，整体上在MOF+/-造血干细胞（scRNA-SEQ，cluster 2和5）和MEPs（scRNA-seq，cluster 6）显著降低，但没有在MPPs降低（scRNA-seq，cluster 4）（图4D）。此外，HSC特异性MOF靶标（cluster 1）（例如Runx1和Fos）示例显示，在分选的Mof +/- HSC（LSK + CD34 - Flt3 - CD48 - CD150 +）中RNA含量降低了（图4E和图S8F），而在Mof +/-细胞（例如Cdk8）的仍结合区域中未观察到RNA水平变化（图4E）。

图4 DEF

接下来，作者有兴趣了解差异ChIP clusters中哪些生物学过程与MOF结合的基因相关联，然后进行了基因本体（GO）术语分析。在HSC中特异富集但不在MEP中富集的靶标（cluster 1 ）似乎富集了与HSC分化相关的术语（图S8G），例如，细胞骨架变化和TF结合（32）。因此，cluster 1 TF 靶基因，诸如细胞命运承诺和细胞分化等生物过程有关被富集（图S8G）。另一方面，cluster 2 MOF peaks（MEPs> HSCs；图S8H）在“核心启动子序列特异性DNA结合”等术语上得到了特异富集。这反映在各自的TF靶标富集中，揭示了“红细胞分化”和“ RUNX1调节基因”。MOF与HSC中的Runx1启动子结合后，进一步加强了MOF与Runx1之间的联系（图4E）。总之，这些分析表明，细胞类型特异性MOF靶标的大部分是HSC和MEP中的TF基因。

为了进一步描述与MOF合作的TF网络，作者执行了TF亲和力预测[TRAP; (33]分析MOF峰（图4F）。除了在两个集群中富含AT的基序，所述细胞类型特异性cluster 1的peaks显著富集到Elf5和Runx1的基序，其作为TFs参与HSC分化（TFS 13，34）。在Cluster 2中，作者发现富集motifs为已知的红系调节子GATA1和ARID3A（35，36）。

接下来，作者着手验证MOF结合与ATAC-see所观察到的染色质可及性变化之间的联系，请参阅（图3，A到D）。为此，作者分析了造血细胞的bulk （37）和单细胞ATAC-seq（scATAC-seq）（38）。在两个数据集中的开放区域内都发现了MOF peak的大量富集。在显示平均相似表达水平的基因对照组中未观察到这一点，这表明可及性并非简单地由基因活性本身驱动，而是与MOF存在相关（图4，G和H）。这表明受MOF绑定区域占了HSCs和MEPs中大多数可访问区域。

fig4 GHL

上面的结果促使作者研究MOF在HSCs和MEPs中可及区域是否特别富集到红系轨迹（图S8I，另请参见材料和方法）。为此，作者使用了基于DNA motif的方法，从对已发布的scATAC-seq数据进行伪时间分析开始。作者沿红系轨迹从每个细胞中可及的位点提取了k- mer信息[flanking 7 bp of scATAC-seq peak，如STREAM（39）中所述]。图4I）。接下来，作者从HSCs和MEPs中的每个MOF ChIP-seq TSS峰中提取了 k-mer信息。然后，作者 询问两组（HSCs或MEPs）中获得的MOF-peak k-mers 是否在给定群轨迹的可访问位置和/或特征处显着富集。HSC-MOF k-mers被特异富集在HSC-MPP轨迹的可及基序（图4J）。MEP-MOF k-mers，相反，更致力于MPP-MEP细胞轨迹（增加图4K）。作者的分析表明，细胞类型特异性MOF k- mers在HSC-MPP和MPP-MEP拟轨迹中大量富集（图4，J到L）。

图4 JK

总之，作者分析表明，HSC和MEP中的MOF结合位点与这些阶段的开放染色质区域相关。这种由MOF介导的染色质可及性决定了红系细胞的命运。

GFI1B对Mof表达的细胞特异性调控

考虑到MOF沿红系轨迹的动态表达和全基因组范围的占用，作者预测Mof基因本身受谱系特异性TFs动态控制。因此，作者接下来将注意力集中在Mof启动子的调控上。作者在小鼠和人类Mof启动子中进行了单个基序占用预测，并确定了TF GFI1B的两个连续基序的保守富集（图5A）。在已发布的GFI1B ChIP-seq资料中，GFI1B似乎富含在HPC7细胞的Mof启动子区域（图5B）（40）。由于Gfi1b是RUNX1的直接下游靶（41），它本身就是一个MOF目标，作者推测转录因子Runx1的和Gfi1b参加与循环监管MOF是逐步触发红系命运承诺。为了验证针对这些因素的靶向性，作者在HPC7细胞中进行了ChIP定量聚合酶链反应（qPCR）实验，该实验可再现证实RUNX1与Gfi1b启动子结合和GFI1B与Mof启动子的结合（图5C）。

Fig5 ABCDE

Mof mRNA水平在红细胞生成过程中显示两个峰值（图3F）。scRNA-SEQ数据集揭露了在体内第一个表达峰值MOF与Runx1的表达重合，第二个具有增加Gfi1b水平（图S9A）。此外，Mof +/-动物还显示Runx1和Gfi1b的调控异常（Figs. 4E and and5D5D and fig. S9A）。调查MOF表达是否需要Gfi1b，作者在HPC7细胞中进行小干扰RNA（siRNA）掉低（KD的）Gfi1b，其通过免疫荧光显示其有着显著降低的MOF水平（图5E）。为了进一步剖析这一机制，作者接下来进行了荧光素酶报告基因检测，以比较野生型Mof启动子和突变的Mof启动子，其中39bp GFI1B结合区被改写（图5F）。该测定法在HPC7细胞（较幼稚的状态）和K562细胞（较红系定型的细胞）中进行。作者观察到HPC7和K562细胞中明显的Mof启动子活性，该活性在GFI1B结合位点突变或Gfi1b KD完全消失。当在K562细胞中异位表达Gfi1b时，该报告基因构建物的活性得以增强，而在HPC7细胞中，这种作用相当微妙。此外，GFI1B对Mof启动子的这种调节似乎具有高度的细胞类型特异性，因为作者到外周血单核细胞（Wehi3）或人胚胎肾（HEK）293T（非造血起源）中启动子突变后没有观察荧光素酶活性的降低。

图5 F

为了探索Runx1和Gfi1b对红细胞生成的功能相关性，作者将细胞分选为Runx1 KD或Gfi1b KD HSCs（LSK + CD34 - Flt3 - CD48 - CD150 +）单细胞放入基于甲基纤维素的预涂孔中（图5G）。培养10天后，作者观察到Gfi1b KD HSCs集落形成明显减少。HSCs中的Runx1 KD导致BFU-E能力受损，但能够维持CFU-GM的形成（图5，H和I）。与作者先前的观察结果一致，Gfi1b KD导致Mof表达降低。反过来，Runx1 KD导致Mof和Gfi1b水平降低（图5J）。总体而言，这些数据强烈支持“通过与Mof其启动子的直接结合，GFI1B调节Mof发挥积极作用”。因此，Gfi1b和Runx1共同参与一个调节网络，控制着对红细胞生成至关重要的染色质可及性调节剂（MOF）的表达。总的来说，作者发现谱系特异性TF和MOF介导的组蛋白乙酰化的顺序作用有助于红系的命运。

图5 GHI fig5 J

通过乙酰化再平衡和强制红系命运挽救异常的红系轨迹

图6 ABC

鉴于这些复杂且准确定时的事件，作者想进一步了解Mof如何调节红细胞生成过程中的表达动态。因此，作者对scRNA-seq数据进行了伪时间分析。发现了红系命运最高概率cluster 3（红细胞）群（图6A， 图S9B，以及材料和方法）。使用该簇作为终点，作者计算了命运偏倚，并从主分化曲线中提取了属于红系轨迹的细胞[参见（25）]。总共分选了264个野生型细胞和215个Mof +/-细胞，并分析了沿红系轨迹的14,279个基因的表达。具有相似表达模式的基因被聚集到同个节点中（Pearson相关系数，> 0.85；基因/节点列表在补充数据中提供）。这项分析使作者能够确定沿轨迹的基因表达活动的时间。总体而言，作者发现Mof +/-动物与野生型的基因表达模式相比存在显著差异（图6B）。例如，正常情况下，节点1至16中共有3449个基因在早期阶段表达，但在Mof +/-动物中，它们在伪时间晚得多（图6，B和C）。通常在Mof单倍不足的分化后期， Zfpm1等在谱系定型的阶段（节点45至49，2966个基因）中正常表达的基因未显示出统一的表达模式。Mof本身出现在节点42中，该节点在Mof +/-细胞中谱系确定的阶段显示出单个明显的峰。节点42也含有红细胞生成的主调节剂，如Klf1，GATA1，Gfi1b和EPOR，与MOF相似，MOF* +/-小鼠晚期相对于野生型，显示显著异常上调。此外，通过GO分析（图S9C，请参阅补充数据），该cluster显示出对已知红系TF的富集。在Mof +/-轨迹中发现的这些显著差异也通过Monocle在基于轨迹的差异基因表达分析中得到了评分，相比野生型Mof +/-细胞，明显下调的基因有1063个（P <0.05；请参阅补充数据）。些分析表明，在Mof +/-小鼠中少数HSCs红系命运的确完全发生了异常。

图6 DEFGHJ 图 KLM

这些发现促使作者测试是否可以通过恢复H4K16ac沉积来拯救红系谱系规范。为此，作者使用了Mof -iKO HSC，将其转染了编码野生型Mof（Mof）或催化失活突变体（Mof E350Q）的表达载体（图6D）。通过异位表达Mof，作者不仅恢复了Runx1和Gfi1b的水平，而且还恢复了红系集落的形成。相比之下，Mof催化突变体无法挽救这些特征（图6，E和F和图。S9D）。接下来，作者想知道是否可以通过表达主要的类红细胞TF或提高乙酰化水平来改善这些促红细胞生成的干扰。为此，作者用Gata1的表达载体转染了Mof -iKO HSPC，并通过FACS对HSC进行了分类（图S9E）。平行地，用组蛋白脱乙酰酶抑制剂例-527处理MOF -iKO或MOF +/-造血干细胞（处理过的42，43），以提高总体H4K16ac水平。集落形成试验表明，在两种情况下，红系轨迹均被完全拯救（图6，G到M和图S9，从F到H）。值得注意的是，异位表达的Mof在野生型细胞中也显示出扰动的集落形成，认为Mof剂量在HSC分化过程中起着至关重要的作用。总之，作者的结果表明，Mof的适当剂量和定时表达可调节TF相互调节的网络，如Runx1，Gfi1b和Gata1，它们的表达受MOF介导的组蛋白乙酰化作用调节（图S9I）。这些结果确立了谱系特异性H4K16ac驱动的染色质可及性在体内红系命运中的关键作用。

总结

看我的样本数据介绍，就知道作者分析的数据很多了吧。现在的难点：就是多组学整合分析，作者在多组学数据整合分析中各组学分析相互验证，并且有很多实验验证，是一篇工作满满的文献，刚入门真正理解还是挺难的，和大家一起学习，至于详细的实验方法和附加图材料，感兴趣的读者看原文哈！https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7314555/#R25 关于此文献对我目前工作所提供的灵感就不和大家分享了，有问题的留言哈！ 头脑风暴：想想阅读此文献你得到了什么好点子？