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####### 1 reads比对 #######
####### 20220108 #######
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基因组文件：reference.fasta
测序数据文件：example_R1.fq.gz example_R2.fq.gz
1 为参考基因组构建索引
samtools faidx reference.fasta
bwa index reference.fasta
2 将测序数据文件比对到参考基因组
-t 设置线程数,-R 添加reads的标签信息,view -Sb 将结果文件由sam转为bam，减少存储。
bwa mem -t 2 \
-R '@RG\tID:example\tPL:illumina\tSM:example' \
reference.fasta \
./example_R1.fq.gz ./example_R2.fq.gz \
| samtools view -Sb - > example.bam
3 比对结果文件进行排序
-@ 设置线程数，-m 每个线程可使用的最大内存，-o 指定输出文件名称
samtools sort -@ 2 -m 10G -o example.sort.bam example.bam
4 去除比对结果中的PCR重复
samtools rmdup -S example.sort.bam example.sort.rmdup.bam
5 过滤比对质量少于20的reads
samtools view example.sort.rmdup.bam -q 20 -O BAM -o example.sort.rmdup.filter.bam
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####### 2 变异检测 #######
####### 20220108 #######
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基因组文件：reference.fasta
比对结果文件：example.bam
注：GATK3中需要单独对bam文件进行局部重比对，以提高Indel附近区域比对结果的准确性，但在GATK4中，
局部重比对的步骤已经自动包含在HaplotypeCaller模块中，无需单独进行。
1 分别对每个样品进行变异检测
用到的GATK模块为HaplotypeCaller，--java-options 设置JAVA的参数 -XX:+UseSerialGC 单线程运行，-ERC 输出GVCF
gatk --java-options "-XX:+UseSerialGC"
HaplotypeCaller -R reference.fasta
-ERC GVCF
-I example.bam
-O example.g.vcf.gz
2 对所有样品的gvcf文件进行合并
用到的GATK模块为CombineGVCFs, -Xmx400g -Xms400g 指定最大内存，-V 每个样品的gvcf文件 -O 指定输出文件名称
gatk --java-options "-Xmx400g -Xms400g -XX:+UseSerialGC"
CombineGVCFs -R reference.fasta
-V example1.g.vcf.gz -V example2.g.vcf.gz -V example3.g.vcf.gz
-O combine.g.vcf.gz
3 群体变异检测
用到的GATK模块为GenotypeGVCFs, -V gvcf文件 -O 指定输出的vcf文件
gatk --java-options "-Xmx400g -Xms400g -XX:+UseSerialGC"
GenotypeGVCFs -R reference.fasta
-V combine.g.vcf.gz
-O combine.call.vcf.gz
4 提取SNP
用到的GATK模块为SelectVariants, -select-type 指定提取类型
gatk --java-options "-Xmx400g -Xms400g -XX:+UseSerialGC"
SelectVariants -R reference.fasta
-V combine.call.vcf.gz
-select-type SNP
-O combine.SNP.vcf.gz
4 过滤SNP
用到的GATK模块为VariantFiltration, --filter-expression 设置过滤参数及阈值
--filter-name 为每个位点添加标记，大于过滤阈值的标记为PASS，否则标记为Filter
gatk --java-options "-Xmx400g -Xms400g -XX:+UseSerialGC"
VariantFiltration -R reference.fasta
-V combine.SNP.vcf.gz
--filter-expression "QD < 2.0 || MQ < 40.0 || FS > 60.0
|| SOR > 3.0 || MQRankSum < -12.5 || ReadPosRankSum < -8.0"
--filter-name "Filter"
-O combine.SNP.filter.vcf.gz
5 提取过滤好的SNP
用到的GATK模块为SelectVariants，--exclude-filtered 去除被过滤掉的SNP，即标记为Filter的位点
gatk --java-options "-Xmx400g -Xms400g -XX:+UseSerialGC"
SelectVariants -R reference.fasta
-V combine.SNP.filter.vcf.gz
--exclude-filtered
-O combine.SNP.filtered.vcf.gz
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####### 3 变异过滤 #######
####### 20220109 #######
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VCF文件：example.vcf
1 去除Indel附近7bp范围的SNP
-g 设置距离，单位bp， -O 指定输出文件格式 v表示未压缩的vcf文件
注：此步需要vcf文件中包含indel，过滤完后将indel去除
bcftools filter -g 7 -O v -o 1.vcf example.vcf
2 去除10bp范围内有大于3个SNP的SNP cluster
1 为vcf文件建立索引
gatk IndexFeatureFile -F 1.vcf
2 为符合要求的位点添加标记SNP cluster，-cluster 指定SNP数目 -window 指定窗口范围，单位bp
gatk VariantFiltration -V 1.vcf -cluster 3 -window 10 -O 2.vcf
3 去除SNP cluster
gatk --java-options "-XX:+UseSerialGC"
SelectVariants -V 2.vcf
-select "FILTER == SnpCluster"
--invertSelect
-O 2.Filtered.vcf
3 将质量值小于20，覆盖的reads数小于5的基因型设为miss即./.
vcftools --vcf 2.Filtered.vcf
--minDP 5 --minGQ 20
--recode --recode-INFO-all
--out 3.Filtered
4 去除非二等位基因、缺失率大于90%，次要等位基因频率小于5%的位点
vcftools --vcf 3.Filtered.recode.vcf
--max-allele 2 --min-allele 2
--max-missing 0.9 --maf 0.05
--recode --recode-INFO-all
--out 4.Filtered
5 过滤连锁不平衡位点
1 转换vcf文件为ped格式
plink --vcf 4.Filtered.recode.vcf
--allow-extra-chr --recode
--out 5.ld
2 将map文件中的第二列改为每个snp位点特有的标识符
awk '{print 1"_"
3"\t"$4}' 5.ld.map > 5.ld1.map
3 修改相应的ped文件的名称
mv 5.ld.ped 5.ld1.ped
4 计算位点之间的ld值, --indep-pairwise 设置窗口、步长、r2值
plink --file 5.ld1
--allow-extra-chr
--indep-pairwise 50 10 0.2
--out ld
5 抽出低连锁的位点，--extract 抽取满足要求的位点，--make-bed 转换为bed格式
plink --file 5.ld1
--allow-extra-chr
--extract ld.prune.in
--make-bed --out filter_ld
6 将bed文件转为vcf文件
plink --bfile filter_ld
--allow-extra-chr
--recode vcf-iid --out filter_ld
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####### 4 系统树、Admixture和PCA #######
####### 20220109 #######
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VCF文件：example.vcf
BED文件：example.bed
系统树
1 将SNP转为fasta格式，用到的软件为vcf2phylip.py(https://github.com/edgardomortiz/vcf2phylip)
python vcf2phylip.py -f -i example.vcf
2 megacc 构建NJ树
infer_NJ_nucleotide_NOld.mao为参数文件，常用参数如下：
[ AnalysisSettings ]
Analysis = Phylogeny Reconstruction
Scope = All Selected Taxa
Statistical Method = Neighbor-joining #指定建树方法
Phylogeny Test = ====================
Test of Phylogeny = Bootstrap method
No. of Bootstrap Replications = 1000 #指定Bootstrap次数
Substitution Model = ====================
Substitutions Type = Nucleotide
Model/Method = p-distance #指定模型
Number of Threads = 4 #指定线程数目
-a 指定参数文件，-d指定序列文件
megacc -a infer_NJ_nucleotide_NOld.mao -d example.fasta -o example_out
3 IQTREE 构建ML树
-s 指定序列文件，-o 指定外类群名称， -T 指定线程数目，-B 指定Bootstrap次数，-m MFP 自动搜索最适合模型并建树
iqtree -s example.fasta -o acoe -T 10 -B 1000 -m MFP
Admixture
1 依次计算K=2到K=20
for k in {2..20} ;do admixture --cv=10 example.bed {k}.out; done
2 处理admixture结果
1 提取出Q文件中的个体顺序
awk '{print $2}' example.fam > ID
2 给Q文件添加个体id
for i in *Q ;do paste ID i.id ;done
3 按照sortID文件中的指定顺序，给Q文件排序
for i in *id ;do python3 sortQ.py sortID i.sort ;done
3 绘图
a <- read.table("sort.5k",row.names = 1)
b <- t(as.matrix(a))
b.reverse <- b[,324:1]
p <- barplot(b.reverse,space = 0,border = NA,axisnames = F,
col = c("gold","firebrick","DarkGoldenrod4","IndianRed1",))
axis(side = 1, p, labels = F, at = c(0:324))
labs <- colnames(b.reverse)
text(cex=.3, x=p-0.25,y=-0.05,labs,xpd=TRUE,srt=45,adj = c(1,1))
PCA
--pca 324 计算324个PC的值，324为输入文件中的个体数
plink --allow-extra-chr --bfile example --pca 324
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