1.创建工作目录，工作目录下存放公司处理过的 cleandata 和 mapping.txt
图1
2.使用 validate_mapping_file.py 验证 mapping.txt 格式是否正确
validate_mapping_file.py -m mapping.txt -o validate_mapping_file_output
图2
在文件管理中找到该.html文件，双击打开
图3
由于是 cleandata，故不需要填写 barcode 和 prime 信息
3.使用 split_libraries_fastq.py 切分数据（主要目的：得到seqs.fna）
mkdir split
split_libraries_fastq.py -i yourmerged.fastq(1.fastq,2.fastq,3.fastq......) -o split -m mapping.txt --barcode_type 'not-barcoded' --sample_id yourfastqid(1,2,3.....)
4.使用 pick_otus.py 进行OTU聚类
mkdir otus
pick_otus.py -i split/seqs.fna -o otus -m uclust_ref -s 0.97 -z -r /usr/local/lib/python2.7/dist-packages/qiime_default_reference/gg_13_8_otus/rep_set/97_otus.fasta
5.使用 pick_rep.set.py 选择代表性OTU序列
mkdir rep_otu
pick_rep_set.py -i otus/seqs_otus.txt -f split/seqs.fna -o rep_otu/rep_set.fna
6.使用 align_seqs.py 进行多序列比对
mkdir align
align_seqs.py -i rep_otu/rep_set.fna -o align -m pynast -a uclust -p 0.75 -t /usr/local/lib/python2.7/dist-packages/qiime_default_reference/gg_13_8_otus/rep_set_aligned/85_otus.pynast.fasta
7.使用 filter_alignment.py 过滤比对结果
mkdir filter
filter_alignment.py -i align/rep_set_aligned.fasta -o filter
8.使用 make_phylogeny.py 构建进化树
mkdir phylogeny
make_phylogeny.py -i filter/rep_set_aligned_pfiltered.fasta -o phylogeny/rep_set.tre -t fasttree
9.使用 assign_taxonomy.py 进行物种分类注释
assign_taxonomy.py -i rep_otu/rep_set.fna -r /usr/local/lib/python2.7/dist-packages/qiime_default_reference/gg_13_8_otus/rep_set/97_otus.fasta -t /usr/local/lib/python2.7/dist-packages/qiime_default_reference/gg_13_8_otus/taxonomy/97_otu_taxonomy.txt -m uclust
10.使用 make_otu_table.py 生成 OTUs table
mkdir otu_table
make_otu_table.py -i otus/seqs_otus.txt -t uclust_assigned_taxonomy/rep_set_tax_assignments.txt -o otu_table/otu_table.biom
11.使用 biom convert 将转换biom文件格式为txt格式
mkdir biom
biom convert -i otu_table/otu_table.biom -o biom/otu_table.txt --to-tsv
12.使用 biom convert 统计 otu_table.biom
biom summarize-table -i otu_table/otu_table.biom -o biom/table.summary.txt
13.处理 OTU table
1）按mapping文件顺序排序
mkdir otu_table_handle
sort_otu_table.py -i otu_table/otu_table.biom -m mapping.txt -o otu_table_handle/sorted_otu_table.biom
2）过滤 OTU 数量大于1
filter_otus_from_otu_table.py -i otu_table_handle/sorted_otu_table.biom -o otu_table_handle/otu_table_mc2.biom -n 2
3）删除异常样品
filter_samples_from_otu_table.py (自行查阅说明)
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