期刊：Science of the Total Environment
影响因子：7.963
近期，派森诺与南京医科大学附属常州市第二人民医院合作，在Science of the Total Environment上发表了题为《USP15 participates in DBP-induced testicular oxidative stress injury through regulating the Keap1/Nrf2 signaling pathway》的研究成果。该研究表明，USP15通过调节Keap1/Nrf2信号通路，对DBP引起的睾丸氧化应激损伤起到保护作用。
1、研究背景
邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是一种广泛应用于工业生产的邻苯二甲酸酯，尤其是塑料工业。DBP由于其内分泌毒性危害大，在世界范围内受到越来越多的关注。流行病学证据表明，长期暴露于DBP可对人体各器官，特别是男性生殖系统造成严重损害。动物实验表明，DBP可灭活雄性大鼠睾酮合成的关键酶，导致生精细胞凋亡和睾丸萎缩。此外，宫内暴露DBP可破坏后代大鼠尿道和生殖结节的分化发育，导致尿道下裂、隐睾等一系列先天性畸形。DBP可诱导体外和体内支持细胞和Leydig细胞凋亡和炎症。既往研究表明，氧化应激损伤在DBP诱导的生殖毒性中起重要作用，Nrf2抗氧化途径可能是机体应对此类外源性损伤的保护机制。去泛素化酶(DUBs)参与多种细胞过程，包括信号转导、蛋白质降解、转录调节、细胞周期调节和DNA修复。
USP15是UBP/USP家族的去泛素酶。USP15可以通过去泛素化Keap1稳定Cul3-Keap1-E3连接酶复合物，导致E3连接酶活性增强，从而导致Nrf2降解。然而，USP15对Nrf2途径介导的抗氧化反应的调控机制尚未明确。本研究旨在阐明USP15在DBP诱导的氧化应激损伤中的作用，并寻找USP15可能的上游调控因子。
2、研究思路
3、研究内容
1. DBP处理后Nrf2通路的激活
DBP处理后Nrf2及其下游抗氧化剂(NQO1、HO-1和GCLC) mRNA水平显著上调，Cul3表达升高，而Keap1则无明显变化。随后，我们通过WB检测Nrf2通路的蛋白表达。结果显示,Nrf2的蛋白质含量明显升高,而Cul3的蛋白表达和Keap1持平。此外,免疫组织化学染色结果进一步验证Nrf2通路的激活。
为了探讨DBP处理后泛素化Nrf2 (Ub-Nrf2)和泛素化Keap1 (Ub-Keap1)的变化，我们做了抗Nrf2、抗Keap1的CO-IP实验。结果显示DBP组中Ub-Nrf2水平降低，Ub-Keap1水平升高。
2. RNASeq揭示DBP处理关键基因变化
我们对DBP处理组和对照组的3对睾丸样本进行RNA测序并分析。差异分析结果共发现4957个上调基因和6016个下调基因。剔除不满足条件的基因后，筛选出25个差异表达的DUBs。随后，我们进行RT-qPCR和western blot进一步验证差异表达。最终发现，经DBP处理后，Cyld、USP1、USP15和Tnfaip3等4个DUB的mRNA和蛋白水平均发生变化。
3. USP15参与Nrf2激活和Nrf2/Keap1泛素化
我们通过过表达Tnfaip3和沉默Cyld、USP1和USP15的表达，模拟DBP处理后四种酶的变化趋势。结果显示，Cyld和USP15敲低后Nrf2、NQO1、HO-1和GCLC蛋白表达上调，而USP1敲低或Tnfaip3过表达后无明显变化。此外，我们还研究了Cyld和USP15敲除后Nrf2和Keap1的泛素化水平是否发生变化。结果显示，USP15敲低后，小鼠体内Ub-NRf2水平降低，Ub-Keap1水平升高。
为了进一步验证USP15对Nrf2或Keap1去泛素化的调控机制，我们分别在HEK293细胞中转染了Myc-USP15及其突变体Myc-USP15-C783A。研究结果显示，USP15能够去泛素化Keap1，但不能去泛素化Nrf2。
4. DBP诱导GC-1和GC-2细胞氧化应激损伤
不同浓度(0、10、50、100 mg/l) DBP处理GC-1和GC-2细胞24 h，检测细胞的氧化应激状态。ROS分析结果显示，随着DBP浓度的增加，细胞氧化应激损伤越严重。
5. USP15的降低增强了DBP处理后Nrf2通路的激活
我们通过慢病毒转染，将USP15在GC-1和GC-2细胞中敲除和过表达来研究USP15对Nrf2通路的影响，结果表明，在DBP处理后，USP15的下调可显著增强Nrf2通路的激活，而USP15的升高则抑制Nrf2通路的激活。
DHE染色显示过表达USP15时，ROS荧光强度增强，沉默USP15时，ROS荧光强度减弱。故在生殖细胞中低水平的USP15表达可减轻DBP诱导的氧化应激损伤，而高水平的USP15表达可加重机体的氧化应激损伤。
6. MiR-135b-5p是USP15的上游调控因子，可减弱DBP诱导的氧化应激损伤
为了探索USP15的上游调控因子，我们做了miRNA转录组测序，包括差异分析和靶基因分析等，最终筛选出miR-135b-5p作为USP15的潜在调控因子。基于USP15的3'-UTR中潜在的结合区域，我们设计了荧光素酶报告质粒，其中包含USP15的3'-UTR中预测的结合位点(USP15-wt)或突变的USP15来观察荧光变化。结果表明USP15是miR-135b-5p的直接功能靶基因，且miR-135b-5p可减轻USP15负调控下DBP诱导的氧化应激损伤。
4、文章小结
综上所述，我们发现Keap1/Nrf2抗氧化途径可能参与了DBP诱导的睾丸氧化应激损伤、睾丸发育不良和精子发生障碍。同时，我们发现DBP处理后Keap1/Nrf2的泛素化途径发生变化。此外，我们还验证了USP15表达的减少可以抑制Nrf2的泛素化降解，缓解DBP诱导的细胞氧化应激损伤。证实了miR-135b-5p可通过负调控USP15减弱DBP诱导的氧化应激损伤。因此，我们推测USP15抑制介导的Keap1/Nrf2泛素化途径的改变可能是机体对DBP引起的睾丸氧化还原状态失衡的自我保护机制。
本研究的miRNA和mRNA测序及分析由上海派森诺生物科技有限公司完成。
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