《生物材料》上交大李海燕/港中文陈汉辉:海藻酸钠水凝胶调节吞噬细

【前沿背景】

炎症反应是典型伤口愈合的关键阶段。尽管已有研究报道某些生物活性物质可以调节巨噬细胞的极化，从而有利于组织再生，但炎症反应的作用，尤其是巨噬细胞在生物物质刺激的组织再生中的关键作用尚不清楚。据报道，生物活性玻璃（BG）和含有BG的水凝胶能够促进硬组织和软组织的再生。但是，尚未完全阐明巨噬细胞在由BG增强的组织再生中的关键作用。

【科研摘要】

近日，上海交通大学李海燕教授携手香港中文大学陈汉辉教授在7月生物材料顶刊《Biomaterials》发表了题为“Modulation of macrophages by bioactive glass/sodium alginate hydrogel is crucial in skin regeneration enhancement”论文。研究了BG /海藻酸钠（SA）水凝胶（BG/SA水凝胶）对巨噬细胞行为以及巨噬细胞与修复细胞之间相互作用的影响。此外，用巨噬细胞耗竭的小鼠来研究巨噬细胞在用BG/SA水凝胶处理的全层皮肤伤口再生中的必要性。结果表明，BG/SA水凝胶可在体外和体内使巨噬细胞向M2表型极化，并上调抗炎基因的表达。此外，M2极化的巨噬细胞可以进一步募集成纤维细胞和内皮细胞，并在体外和体内增强成纤维细胞的细胞外基质（ECM）合成和内皮细胞的血管化。伤口部位巨噬细胞的耗竭阻碍了修复细胞的募集，并减少了血管和ECM的形成，减慢了皮肤的再生。这些结果提供了对生物材料-免疫系统相互作用的见解，并证明了BG/SA水凝胶在炎症反应中对巨噬细胞的调节对于水凝胶增强皮肤再生至关重要。

【图文探讨】

3.1 BG/SA水凝胶对RAW细胞极化的影响

通过流式细胞仪检测表达M1标志物iNOS和M2标志物ARG的巨噬细胞，以研究BG/SA水凝胶对巨噬细胞极化的影响。从图1可以看出，BG/SA水凝胶激活了RAW细胞的M2表型，这是在BG/SA水凝胶培养的总细胞中表达ARG标志物的细胞所占的百分比（12 h 为64.8％±4.3％，和24 h时为88.1±5.9％）高于对照组（12 h时为48.2±3.5％和24 h时为48.6±2.7％）。

图1. 在12小时和24小时后，用正常培养基（对照）和BG/SA水凝胶培养的RAW细胞的FACS结果。

3.2 BG/SA水凝胶对RAW细胞炎症相关细胞因子基因表达的影响

分析了在有或没有BG/SA水凝胶培养12 h和24 h的RAW细胞中几种关键抗炎和促炎细胞因子的基因表达。图2表明BG/SA水凝胶可以显着激活M2表型的巨噬细胞，因为BG/SA水凝胶培养的RAW细胞中抗炎因子TGF-β，VEGF，bFGF，ARG和IL-10的基因表达显着高于用对照培养基在12 h和24 h培养的RAW细胞中的细胞。这些结果与流式细胞仪结果一致。相反，在用BG/SA水凝胶培养的RAW细胞中，促炎细胞因子（例如IL-1β和TNF-α）的基因表达明显低于在用对照培养基培养的RAW细胞中的表达。这表明BG/SA水凝胶可以抑制促炎细胞因子的分泌。

图2. 12小时和24小时后，BG / SA水凝胶和正常培养基（对照）培养的RAW细胞中IL-1β，TNF-α，ARG，IL-10，VEGF，TGF-β和bFGF的基因表达

3.3 不同条件培养基对L929和MAEC细胞迁移的影响

通过Transwell迁移和刮擦试验研究了BG/SA水凝胶激活的巨噬细胞对MAEC（图3A和B）和L929细胞（图3C和D）迁移的影响。从图3A中注意到，与其他条件培养基相比，在用CM-BG/SA培养后24小时，更多的MAEC细胞通过Transwell膜迁移。

图3. 用正常培养基（对照），BG/SA水凝胶（BG/SA），RAW细胞的条件培养基（CM）和用BG/SA水凝胶（CM）培养的RAW细胞的条件培养基培养的MAEC和L929细胞的迁移-BG/SA）。

3.4 不同条件培养基对L929和MAEC细胞组织再生相关分子表达的影响

评估了在不同条件培养基中培养的L929细胞中ECM蛋白的蛋白质和基因表达，包括胶原蛋白I（Col-I），胶原蛋白III（Col-III），弹性蛋白和纤连蛋白（FN），结果分别如图4A和B所示。从图4A可以看出，当用不同培养基培养L929细胞时，它们分泌了这些ECM蛋白。用三种条件培养基培养L929细胞时，分泌的Col-I，Col-III，弹性蛋白和纤连蛋白比对照培养基更多。但是，使用免疫荧光图像很难区分这三个条件培养基组之间的差异。图4B显示，与用对照培养基培养的L929细胞相比，在用CM-BG/SA培养的L929细胞中这些再生相关分子的基因表达均被上调。在不同的条件培养基中，CM-BG/SA能够增强L929细胞中所有四个基因（Col-I，Col-III，弹性蛋白和FN）的表达。相反，与对照培养基相比，在用其他条件培养基培养的L929细胞中再生相关基因的表达并未全部上调。结果表明，BG/SA提取物可以上调L929细胞中Col-I和FN的表达，而CM仅上调弹性蛋白的基因表达。在用CM和对照培养基培养的L929细胞中，Col-I，Col-III和FN的基因表达没有明显差异。因此，与其他条件培养基和对照培养基相比，CM-BG/SA对促进L929细胞的再生相关基因表达的作用最强。

图4. 用不同条件培养基培养的L929和MAEC细胞的行为。

3.5 巨噬细胞在体内 BG/SA水凝胶募集过程中对修复细胞的作用

3.5.2 在正常和巨噬细胞耗竭小鼠中，在BG/SA水凝胶募集下L929和MAEC细胞的迁移

图5显示了在不同条件下L929和MAEC细胞在体内的迁移。在正常小鼠中，GFP荧光图像和免疫组织化学染色图像均表明，向注入BG/SA水凝胶的位点迁移的L929细胞比向注入SA溶液的位点迁移的更多（图5A）。MAEC获得了相似的结果（图5B）。在消耗巨噬细胞的小鼠中，GFP荧光图像和免疫组织化学染色图像均表明，向注射有BG/SA水凝胶的伤口部位和向SA溶液迁移的L929细胞数量之间没有显着差异（图5C）。再次在巨噬细胞耗竭的小鼠中观察到MAEC的相似结果（图5D ）。

图5. 正常小鼠和巨噬细胞耗竭小鼠中MAECs和L929细胞的迁移。

3.6 BG/SA水凝胶治疗巨噬细胞在全层皮肤伤口再生中的作用

3.6.1 伤口闭合和HE染色

将BG/SA水凝胶和SA溶液应用于正常和巨噬细胞耗竭小鼠的皮肤组织损伤，以评估BG/SA水凝胶对伤口愈合的影响。皮肤伤口的总体观察和伤口闭合率的代表性图像分别在图6A和B 中示出。用BG/SA水凝胶和SA溶液处理的伤口在不同时间点表现出不同程度的伤口愈合（图6A）。用BG/SA水凝胶和SA溶液处理的正常小鼠的伤口愈合速度比消耗巨噬细胞的小鼠快，这表明巨噬细胞对于伤口愈合至关重要。图6B进一步证实了这一发现，因为在所有时间点，巨噬细胞BG/SA组和巨噬细胞SA组的伤口闭合率均高于巨噬细胞-BG/SA组和巨噬细胞-SA组。另外，在正常小鼠中，巨噬细胞BG/SA组的伤口闭合率高于巨噬细胞SA组。相反，在消耗巨噬细胞的小鼠中，用BG/SA水凝胶（Macrophage-BG/SA）处理的伤口的闭合率与用SA溶液（Macrophage-SA）处理的伤口相似（图6A和B）。

图6. 伤口愈合有不同的治疗方法。

3.6.2 BG/SA水凝胶对伤口部位巨噬细胞行为的影响

用BG/SA水凝胶或用SA溶液处理的正常和缺乏巨噬细胞的小鼠的伤口中的总巨噬细胞和M2巨噬细胞被分别标记，结果显示在图7中。图7A显示了在第3天和第7天，正常和缺乏巨噬细胞的小鼠伤口部位的总巨噬细胞的CD68免疫组织化学结果。图像显示，在巨噬细胞耗尽的小鼠的伤口部位观察到的巨噬细胞少于伤口处的巨噬细胞。在BG/SA水凝胶或SA溶液组中正常小鼠的两个部位，表明通过氯膦酸盐-脂质体注射来清除巨噬细胞是有效的。重要的是，在消耗巨噬细胞的小鼠和正常小鼠中，用BG/SA水凝胶或SA溶液处理的伤口部位的总巨噬细胞数量没有显着差异。

图7. 在第3天和第7天，用BG/SA水凝胶或SA溶液治疗正常小鼠和巨噬细胞衰竭小鼠的伤口中CD 68的免疫组织化学染色（用于鉴定通用巨噬细胞）和CD163（M163）用于鉴定M2表型巨噬细胞。

3.6.3 免疫组织化学染色

Masson染色用于在小鼠中用BG/SA水凝胶或SA溶液处理的伤口中的胶原蛋白染色。沉积的胶原蛋白在图8中被染成蓝色不仅提供有关胶原蛋白沉积的信息，而且还提供有关沉积胶原蛋白结构的信息。7天后，在BG/SA水凝胶或SA溶液组中，与正常小鼠相比，在巨噬细胞耗竭小鼠的伤口部位沉积的胶原蛋白更少。另外，在正常小鼠的伤口部位可见胶原纤维结构，但是在巨噬细胞耗竭的小鼠中很难观察到。在消耗巨噬细胞的小鼠中，用BG/SA水凝胶和SA溶液处理的伤口部位之间的胶原沉积没有显着差异。相反，在正常小鼠中，与SA溶液相比，在用BG/SA水凝胶处理的伤口部位可以观察到更多的蓝色胶原蛋白染色。

图8. 在第7天和第14天，在正常小鼠和巨噬细胞耗竭小鼠中，用BG / SA水凝胶或SA溶液处理的伤口的Masson染色。

【陈述总结】

在这项研究中，已通过使用体外试验和耗竭巨噬细胞的小鼠模型阐明了巨噬细胞在BG/SA水凝胶增强的皮肤伤口愈合中的关键作用。结果表明，当BG/SA水凝胶用于治疗皮肤伤口时，巨噬细胞是必不可少的，因为在巨噬细胞耗竭小鼠中缺乏巨噬细胞会显着阻碍BG/SA水凝胶介导的皮肤再生。当伤口处存在巨噬细胞时，BG/SA水凝胶可调节巨噬细胞的M2表型，从而分泌促再生细胞因子和趋化因子。然后，M2巨噬细胞可以将修复细胞，例如成纤维细胞和内皮细胞募集到伤口部位，并增强内皮细胞的血管生成和成纤维细胞的ECM分泌，从而促进肉芽组织的形成。在没有巨噬细胞的情况下，BG/SA水凝胶可能会直接激活修复细胞，但由于在没有M2巨噬细胞的情况下募集到伤口部位的修复细胞明显减少，因此治疗效果减弱。

【通讯简介】

李海燕，现任上海交通大学生物医学工程学院Med-X 研究院长聘副教授。2005年毕业于中国科学院上海硅酸盐研究所生物材料与组织工程研究中心，获材料工程学博士学位，导师为常江研究员。2005年7月至2006年3月就职于联合利华中国研究所。2006年4月至2008年11月在澳大利亚莫那什大学 (Monash University) 进行博士后研究。2008年12月至2011年2月在法国国家医疗与卫生研究所 (INSERM)生物材料与组织修复实验室 (U1026) 进行博士后研究。2011年，李海燕加入上海交通大学生物医学工程学院Med-X研究院并于2015年获聘上海交通大学长聘教轨副教授。回国后，其先后承担和完成3项国家自然基金面上项目以及多项上海市科研项目，获得上海市2012年“浦江人才”奖励以及上海交通大学2016年“晨星计划”A类人才奖励。其主要研究领域为生物材料与组织工程，共发表SCI论文70余篇，2章外文专著及申请了8项专利，论文总引用次数约为2400次。在研究过程中，获得12项基金资助，其中包括作为项目负责人的3项国家自然基金，作为合作申请者的2项上海交通大学医工交叉重点基金，作为项目负责人的3项上海市基金等。目前主要研究方向是生物材料与组织工程，组织工程血管化，骨组织工程。

陈汉辉，香港中文大学（港中大）组织工程与再生医学研究所和生物医学学院的助理教授。他于2010年从香港大学获得了学士学位。然后，他继续攻读硕士学位。在Sir Edward Youde Memorial Fellowships海外研究纪念奖学金的支持下获得杜克大学博士学位。在他的博士学位期间在培训中，他专注于开发几种微流体技术来进行间充质干细胞和肝细胞的3D球体培养，并研究了补充细胞外基质提示对球体功能的影响。2015年毕业后，陈汉辉在哥伦比亚大学（Columbia University）担任了一年的博士后研究员。他使用微流体液滴对合成基因进行了高通量筛选，以优化蛋白质表达。2016年，加入麻省理工学院，担任博士后助理。在那里，他进行了片上器官研究，并开发了生物力学指导的折叠水凝胶，以概括在人体中空或管状器官中观察到的粘膜折叠形态。

参考文献：

doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.120216

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