写在前面

最近在捣鼓表观遗传学，处理了一批Bulk RNA-Seq和WGBS(Whole Genome Bisulfite Sequencing)的数据。熟悉我风格的粉丝都知道，我一般会读几篇文献再下手，遂于PubMed中检索了几篇文章，发现一个2022年发表的题为"Comparative WGBS identifies genes that influence non-ripe phenotype in tomato epimutant Colourless non-ripening"似乎内容比较简单，算上图片正文也不过区区七页，比较适合刚开始学习WGBS的同学阅读。这篇文章以杭州师范大学为第一单位于2018年发表在《Science China-Life Science》，彼时影响因子为3.085，即时影响因子为10.384。

具体内容

番茄不是我们研究的重点，其作为一种模式作物被广泛的应用于植物的生理学、分子生物学研究。SIMADS-RIN作为转录因子可以调控相关基因阻碍番茄的颜色成熟，通过病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIG)可以逆转番茄的颜色障碍(colourless non-ripening，cnr)(Fig.1B)，SlCMT3作为一种甲基化酶也可以通过两个甲基化区域(Fig.1C)阻碍SlSPL-CNR的表达(Fig.1A)，导致番茄的cnr。因此，再加上一个"高着色的"high pigment(hp)分组和野生型Ailsa Craig(AC)组，就组成了本篇文章的所有研究分组。作者通过先验知识分析了20个与番茄发育及成熟相关的基因，发现其中包括SlSPL-CNR, SlNOR, SlMADS-RIN, SlTAGL1 and SlPDS在内的12个基因存在差异甲基化区域(different methylation regions, DMR)，并且相较于野生型来说这些DMR大都甲基化水平升高，但在通过VIG"治疗"的样本中甲基化水平有所回调( Fig.1C)。

Fig.1

此外，SlFUL1/SlTDR4 (Fig.2A)和SlGRAS(Fig.2B)在DMR分析中也展现出了与SlSPL-CNR类似的趋势。而这些基因的转录组水平也在花期后展现出了对应的差异(Fig.2C-D)。

Fig.2

而SlTAG1的甲基化水平高低与转录组水平之间并无严格的对应关系，因此作者认为该基因对cnr的表观遗传学变异并无显著贡献(甲基化未必会引起基因表达量波动，此处建议通过可变剪切寻找二者关联)。而与花青素合成相关的SLAN2则在甲基化水平(Fig.3B)与转录组(Fig.3D)水平上均展现出了对应的差异，这一基因启动子上的甲基化水平升高与转录组水平降低对cnr的出现贡献度较高。

Fig.3

在SlCMT3-VIG组中，SlDET1(Fig.4A)和SlPDS(Fig.4B)的甲基化水平下降，而这一基因的高表达也有利于番茄的着色(Fig.4C)(这里似乎有些矛盾，hp组并未展现出SlDET1表达量的明显优势)。因此作者利用PVX作为载体，向植株递送SIDET1c与SIDET1n，可以明显看出相较于空载体(Fig4E)而言，递送了SIDET1c(Figure E-F)与SIDET1n (Figure H-I)的番茄出现了明显的棕色着色。

Fig.4

类似地，作者对SlPDS也进行了相同的实验并获得了类似的效果(Fig.5)。

Fig.5

聊聊读后感

虽然我目前在WGBS和bulk RNA-Seq不像在scRNA-Seq中那样具有一定经验，不过还是能看出这篇文章的内容有所欠缺：
1、对于任何高通量测序项目来说，只挑选一些先验基因观察趋势都是一种很浪费的行为。作者挑选的20个基因中包含DMR且转录水平符合趋势的屈指可数，若只想观察特定基因，无需大费周章，一代测序+QP即可达到目的。正常的分析思路因先从DMR与差异表达基因入手，相信能筛选出大量的关键基因作讨论。
2、除了甲基化分值峰图和转录水平的柱状图，该文几乎没有任何多余的分析。全文的figure过于千篇一律，一些唾手可得的相关性分析与富集分析纳入考虑。
3、作者看起来毫无逻辑地讨论了一些基因，也有可能是我的理解能力有限，整体给我感觉读起来有些乱，尤其是有些基因名似乎敲错了：

当然这篇文章有其成功之处，作者显然对分子生物学操作较为精通，做了很多沉默以及基因转入的试验，并且获得了明显且直观的表型。作者从二十个先验基因中找到能够影响番茄着色的关键基因，想必少不了辛苦耕耘，Salute！

参考：

Chen, W., Yu, Z., Kong, J. et al. Comparative WGBS identifies genes that influence non-ripe phenotype in tomato epimutant Colourless non-ripening. Sci. China Life Sci. 61, 244–252 (2018).