1.DNA提取基本原则

1.1保证DNA结构的完整性

不同的下游实验对于DNA结构的完整性有所区别。
如PCR、Southern杂交这一类实验基本保证所需片段的完整，而二代测序实验为了获得全面的序列信息对DNA的完整性要求更高。

1.2保证DNA的纯度

去除对下游实验中酶分子有抑制作用的有机溶剂和高浓度金属离子
将蛋白质、多糖、多酚等生物大分子的污染降到最低
去除其他核酸（如RNA对后续实验的影响）

2.样本类型与特点

2.1常规医疗样本

血液、动物组织、培养细胞、鼠尾等
特点：细胞数量较多、样本成分相对单一

2.2特殊医疗样本

血清、血浆、鼻咽拭子、痰液、支气管/肺泡灌洗液、腹水、病毒、粪便、FFPE样本等
特点：细胞数量少、样本成分复杂

2.3植物样本

普通植物：拟南芥、小麦、玉米、水稻等
特点：存在细胞壁这样的保护结构、细胞内部还有液泡、叶绿体等细胞器成分相对复杂
多糖多酚类植物：水果果肉、植物种子等
特点：多糖与核酸理化性质一致、多酚氧化后易于核酸结合，影响DNA的提取

2.4微生物样本

细菌:革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌等）、革兰氏阴性菌（大肠杆菌等）
特点：有细胞壁，有的细菌还有鞭毛和荚膜
真菌：酵母、真菌菌丝等
特点：存在以多糖为主要成分的细胞壁、细胞内部成分相对复杂

3.DNA提取纯化流程

DNA提取纯化流程

3.1样本采集与保存

3.1.1新鲜

新鲜样本中受到内源性核酸酶影响相对最小，得到DNA质量相对更好。

3.1.2适量

投入过多样本，后续样本裂解不充分从而影响DNA提取情况，还会引入过多杂质及内源性核酸酶。

3.1.3不同类型的样本在采集与保存时也会存在差异

3.1.3.1植物组织

对于含有多糖多酚等次生代谢产物的衰老叶片可在4℃黑暗环境下饥饿1-2天；进行低温或冷冻保存可以避免内源性DNA酶对样本中的DNA进行一个降解。

3.1.3.2动物组织

-20℃短期保存（1-3个月），-70℃长期保存；福尔马林固定时间8-24h内为宜，样本存放时间不宜超过1年；FFPE样本保存温度4℃，建议不超过3年。

*不同样本因含有内源的酶和DNA的量有所差异，保存时间也有不同

长时间使用福尔马林进行固定，里面有效成分甲醛会引起生物大分子之间形成广泛的亚甲基交联桥使DNA分子脆性增加，在剪切力的作用下，DNA分子容易断裂，同时DNA与蛋白质之间经广泛交联之后，可形成牢固的复合物，这样也阻止蛋白酶对组织的消化，从而影响DNA的提取。

3.1.3.3血液（全血）

可使用不同抗凝剂的抗凝管进行采集和保存；避免反复冻融，4℃短期保存3-4天，-20℃下可最多保存2年，-70℃下长期保存：全血、白细胞、血凝块、血清或血浆。

3.2样本处理方式

3.2.1动物组织

液氮研磨或匀浆

3.2.2植物组织

液氮研磨（最推荐）
研磨充分又保证样本处于低温条件下避免DNA降解

3.2.3哺乳动物血液样本

DNA存在于含有细胞核的白细胞中，而大量存在的红细胞会引入更多杂质和核酸酶，所以需要提前使用红细胞裂解液对红细胞进行去除。

3.2.4细胞样本

贴壁细胞胰酶消化处理再做收集
悬浮细胞只要离心弃上清

3.2.5细菌样本

溶菌酶破壁处理
如金黄色葡萄球菌加入一定量的溶菌酶在37℃条件下孵育30min就可完成破壁的处理

3.2.6真菌样本

酶解破壁或液氮冻融或超声裂解法

3.2.7 FFPE样本

脱蜡处理（二甲苯或矿物油类的物质进行脱蜡处理）

*脱蜡不完全，残留的石蜡会阻碍裂解液对组织的渗透，从而抑制蛋白酶k与组织内蛋白的接触，进而影响组织裂解以及DNA的释放。

3.3样本裂解方法、原理及优缺点比较

3.3.1基因组DNA

3.3.1.1 CTAB法

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，可以溶解细胞膜，与核酸结合形成在高盐环境下可溶的复合物。

*低于15℃会形成沉淀，并且析出，将其加入到冰冷的样本之前必须要预热，并且后续的离心温度一定不要低于15℃！

CTAB裂解液主要组分及作用：

1.Tris-Hcl (PH8.0) 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏
2.EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性
3.Nacl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解于液相中
4.CTAB裂解细胞，与核酸结合形成在高盐环境下可溶的复合物

3.3.1.2 SDS法

SDS法（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去垢剂，高温（55-60℃）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析，在高盐环境下或降低温度后蛋白、多糖等结合形成的复合物沉淀，释放核酸。

3.3.2质粒DNA

3.3.2.1碱裂解-SDS法

在氢氧化钠（PH12-12.6碱性环境）和去污剂SDS的作用下细胞破裂，细菌蛋白质和染色体DNA变性，双链DNA氢键断裂，DNA变性。加入酸性高盐缓冲液后PH恢复中性，共价闭合环状质粒DNA复性速度快于线性的染色体DNA。细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物被SDS包盖。之后复合物沉淀下来，质粒DNA留在上清中。

3.3.2.2煮沸法

含有Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中加热至100℃使细菌裂解。通过加热破坏细菌外壁的同时有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。温度下降后，闭环DNA形成超螺旋分子，离心时留在上清中。

优缺点比较

3.4纯化方法、原理及优缺点比较

3.4.1沉淀法

酚/氯仿抽提去除蛋白质，之后使用乙醇或异丙醇沉淀DNA

3.4.2离心柱法

通过离心柱上的吸附膜，特异性吸附DNA

3.4.3磁珠法

通过磁珠表面修饰（硅基质）从而特异性吸附核酸

优缺点比较

3.5检测与产物保存

3.5.1浓度

3.5.1.1紫外分光光度计进行测量

检测原理：核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，最大吸收波长是260nm。
优点：操作简便、迅速
缺点：无法区分DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸及其他杂质，易得到浓度虚高值
常见仪器：Nanodrop、Onedrop

3.5.1.2 Qubit荧光计进行测量

检测原理：采用荧光染料与特异的靶分子结合后发出荧光，仪器接收荧光值转化为浓度数据。
优点：灵敏度较高，操作简便
缺点：成本高，价格较贵；无法直接区分降解核酸

3.5.2纯度

3.5.2.1紫外分光光度计进行测量

OD260：核酸的吸光度
OD280：蛋白质的吸光度

OD260/OD280 =1.7-1.9 说明纯度很好
OD260/OD280 <1.7 表明可能有蛋白质残留
OD260/OD280 >1.9 表明DNA可能存在部分降解，建议进行完整度检测或存在RNA残留

3.5.2.2琼脂糖凝胶

判断有无RNA、蛋白残留。1%-2%琼脂糖，上样1-3ul

3.5.3完整度

3.5.3.1琼脂糖凝胶

判断DNA有无降解。1%-2%琼脂糖，上样1-3ul
通过胶图中DNA条带情况来判断
完整的基因组DNA条带单一且明亮，无任何拖尾或弥散。
出现不同程度的降解，胶图中可看到不同程度的拖尾或弥散。降解越严重弥散越亮，片段大小会越小。

3.5.4 DNA样本保存

保存形式：建议分装保存，避免DNA反复冻融，影响DNA的完整性。
保存液：
短期保存：对下游实验中离子浓度要求比较高的——PH为弱碱性的无菌水。
对离子浓度要求不高的——TE缓冲液（Tris、EDTA）。
长期保存：乙醇。
保存温度：-20℃/-80℃下可长期保存，4℃下保存时间最好不超过14天。

4.常见问题

Q1.提取的DNA存在降解

1.尽可能选择新鲜的样本，减少内源酶的作用
2.样本起始投入量不要超过所用方法的起始量标准
3.样本保存时尽可能的避免反复冻融
4.选择合适的处理方式并进行充分的样本前处理
5.前处理结束后在样本解冻前添加裂解液
6.需对样本进行充分裂解
7.正确添加所需试剂种类及使用量，样本量增加时裂解液也需成倍增加
8.对得到的DNA产物进行分装保存，避免反复冻融且保存时间不易太久

Q2.提取的DNA产量低

1.事先了解好提取样本中DNA含量水平
2.样本中发生DNA的降解，产量也会有所下降
3.选择合适的前处理及裂解方式（如延长裂解和沉淀DNA的时间等），并尽可能的将样本中的DNA完全释放出来
4.使用柱式试剂盒对DNA产物洗脱的时候，要尽可能的覆盖整个吸附膜；进行二次洗脱也可增加产量
5.使用沉淀法提取DNA时，可以在沉淀之前加入1/10体积的醋酸钠（PH5.2）有助于DNA沉淀

Q3.提取的DNA纯度低，影响下游实验结果

1.样本投入量不要太多，投入太多杂质也多以及后续裂解也不完全
2.样本应进行充分裂解，特别是对于一些比较复杂、含有较多杂质（多糖、多酚等）的样本需进行特殊处理
3.RNA残留：使用RNase对RNA进行处理，处理时间不宜太短（5min左右）
4.蛋白残留：使用蛋白变性剂或蛋白酶K
沉淀法分层吸取上清(DNA)时注意不要吸到下层沉淀蛋白

多酚：

1.抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇，抗坏血酸，半胱氨酸，二硫苏糖醇等
2.加入易与酚类结合的试剂：如PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合

多糖：

1.高盐法：用高浓度的Na+、K+改变多糖的溶解特性，使其脱离水相进入有机相，然后用酚仿抽提去除
2.低浓度乙醇和醋酸钾溶液可以共同沉淀多糖
3.PVP/PVPP类物质对多糖的去除也有一定作用

Q4.提取的质粒DNA产量低

1.质粒拷贝数
低拷贝质粒：pBR322、pACYC及其衍生载体、pSC101及其衍生载体、SuperCos、pWE15等
高拷贝质粒：pTZ、pUC、pBS、pGM-T等
低拷贝质粒适当增加样本投入量
2.菌种问题：保存时间、抗性筛选
如保存时间过久，提取质粒之前，这个质粒已经丢失，这种情况可选择活化，涂布平板培养后，重新挑选新的菌落来进行液体培养
3.选择合适的前处理及裂解方式，并尽可能的将样本中的DNA完全释放出来
4.使用柱式试剂盒对DNA产物洗脱的时候，要尽可能的覆盖整个吸附膜；进行二次洗脱也可增加产量

Q5提取的质粒DNA开环或线性化严重

1.菌种收集时间
对于老旧菌种所含有的开环质粒的量明显高于属于对数生长期的菌种的。根据使用菌种生长情况找到对数生长期。一般来说对数生长期是生长速率常数最大，细胞分裂所用的代时最短的时候就是对数生长期。
2.胞内酶含量很高的宿主菌
先去除胞内酶，再提取质粒
3.变性裂解的时间不宜过长，也会对质粒完整性造成影响
4.碱裂解法加入中和液后操作应该轻柔(裂解时间不宜超过5min）

Q6.提取的质粒DNA纯度低

杂质有3种
1.RNA残留
使用RNase对RNA进行消化处理
2.基因组DNA残留
温和操作
在裂解或中和过程中，操作过于剧烈而导致基因组DNA的断裂
3.蛋白残留
使用蛋白变性剂或蛋白酶K进行消化
碱裂解法将中和后的体系置于4℃一段时间，使蛋白质残留沉淀下来更少
中和均匀彻底，将蛋白与试剂充分融合