以下文章来源于园艺研究 ，作者吴昕扬
园艺研究
《园艺研究》（Horticulture Research）是南京农业大学主办的英文学术期刊，采用开放获取形式，专注刊载和园艺作物有关，能引起广泛的国际和学科兴趣的基础和理论研究。
豆类作物是世界第二大作物，豆类蔬菜则是我国和东亚、东南亚国家重要的蔬菜门类。菜豆（别称四季豆、架豆、油豆角等）、菜用大豆（毛豆）、豇豆、豌豆、扁豆等是种植最广泛的豆类蔬菜，但目前除大豆外，其他豆类蔬菜的遗传转化还较为困难，严重制约了其功能基因组学研究。
2023年4月，Horticulture Research上线了（Advance Access）中国计量大学徐沛课题组题为A molecular toolkit to boost functional genomic studies in transformation-recalcitrant vegetable legumes 的论文。
本研究开发了并展示了一个针对难以进行稳定遗传转化的豆类蔬菜（菜豆、豌豆、豇豆）的高效易用的分子工具包，用于在不依赖稳定转基因的情况下开展基因功能研究，具体包括了以下技术体系：
叶片原位瞬时基因过表达系统。基于农杆菌真空浸润在活体上进行瞬时过表达。利用该手段在菜豆、豇豆、豌豆等豆类蔬菜中进行了蛋白亚细胞定位和双分子荧光互补试验，证明在本物种中的表达优于烟草异源表达系统。同时，应用该系统对菜豆重金属响应基因PvXTH23进行了抗逆功能验证，进一步证明了其实用性。
基于农杆菌的原位瞬时RNA干扰系统。通过构建并表达带有发夹结构的载体，对内源基因进行RNA干扰。选择了ABA途径中的关键基因ABA3进行测试，该基因被报道参与ABA的生物合成和气孔的开合。分别在菜豆、豌豆、豇豆中将ABA3进行瞬时沉默，沉默效率最高可达74%。同时检测到ABA3沉默后ABA途径下游基因的表达下调并伴随着气孔的开放，证明了该系统在豆类蔬菜基因功能研究中的可靠性。
基于烟草脆裂病毒（TRV）的基因长时过表达系统。通过克隆已知的广谱抗性基因PvPR1，连接TRV-RNA2，构建了其TRV表达载体，并浸润菜豆叶片。农杆菌浸润7天可观察到目标蛋白的荧光信号，且能够至少持续至15天后，也能观察到其抗病的表型。同时也在其他豆类蔬菜上上观察到了类似的结果。该技术适合于需要基因长时间表达的研究场景。
多靶点基因编辑系统。目前尚无CRISPR / Cas介导的基因编辑在菜豆中应用的报道。作者利用大豆中开发的pGmUbi-Cas9-4XsgR载体，在菜豆中建立了多靶点基因编辑系统。设计了靶向PvPDS基因的四个sgRNA，构建多重敲除载体，并进行发根农杆菌侵染。对发状根的测序结果显示，基因编辑效率达到68.75%，证明了该系统在菜豆中的有效性和在豆科作物中进行基因操作的巨大潜力。
综上所述，作者开发了一个高效且易于操作的分子工具包，可以在很大程度上打破豆类蔬菜基因功能研究的瓶颈。
图1 本研究开发的豆类蔬菜分子工具包
中国计量大学生科院植物表型计量与质量安全实验室青年教师吴昕扬博士为本论文第一作者，张培培博士（现单位：之江实验室）为本文做出重要贡献，徐沛研究员为论文通讯作者。该研究获得了国家重点研发计划项目（2022YFE0198000）、国家自然科学基金青年项目（32202470、32202521）、省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室开放基金（2021DC700024-KF202217）以及浙江省自然科学基金（LQ21C150004）资助。同时，感谢南京农业大学喻德跃教授馈赠多重基因编辑载体。
作者团队介绍
徐沛课题组长期从事园艺作物生理表型组学和豆类蔬菜遗传改良研究，在农工信学科交叉融合方面形成了一定特色。近2年研发了高通量表型—基因型联合解析系列新方法和具有自主知识产权的新型高通量植物柔性传感器系统，部分研究成果已发表在Plant J、iScience、J Hazard Mater、JAFC、Hortic Res等杂志。
团队合照
文章链接：
https://doi.org/10.1093/hr/uhad064
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