测序：每个物种的基因控制生物性状的表达，而测序是指对基因的序列进行判断。
思路：疾病一般来说主要是在分子水平发生了改变，如何知道分子水平发生了改变？
1.知道正常的序列是什么样的
2.测出相应疾病的待测序列
- 将正常序列和待测序列进行比对
DNA 测序;
测已知序列还是未知序列
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染色体：细胞核中载有遗传信息（基因）的物质，在显微镜下呈丝状或棒状， 由核酸和蛋白质组成
DNA：是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸。是一种分子，双链结构。DNA分子极为庞大（分子量一般至少在百万以上）。
基因：是指携带有遗传信息的DNA序列，是控制性状的基本遗传单位。也就是说能够复制表达的DNA才叫基因。
DAN复制
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起始： DNA复制发生在基因组的特定位置，也就是起始点，复制起点的识别由起始蛋白复合物负责。由引物酶触发。
延续：解旋酶，拓扑异构酶，DNA聚合酶
前导链是连续复制的
后随链由于方向相反，形成一个个冈崎片段，直到复制完成，通过核酸外切酶将引物切除，DNA多聚酶和DNA连接酶填补缺口。
终止：DNA复制将在复制终止位点处终止，并不一定等全部[DNA合成完毕
DNA的体外复制和体内复制并不是完全相同的两个概念。严格上来说，DNA聚合酶开始合成DNA并不一定需要特定的引物，它所需要的是3‘的羟基末端。在体内，DNA复制时是由特殊的复制起始复合体去识别DNA的复制起始位点，然后合成一小段RNA，接着由DNA聚合酶去识别这一小段RNA并在其3’羟基末端添加新的核苷酸开始合成DNA。对于体外复制，也就是通常说的PCR，PCR系统中是没有一个特定的起始复合体去识别特定的起始序列的，这种情况下，起始的特异性实际上是由人工合成的一小段单链寡聚DNA来承担的，也就是我们说的引物，在PCR反应中，寡聚DNA引物通过碱基互补配对原则来和原始的DNA模板结合，然后提供3‘羟基末端供DNA聚合酶来识别，接着完成DNA的聚合。
一代测序（Sanger测序）
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是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行PCR 扩增直接测序。
在合适的条件下，当DNA模板、引物及脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在时，DNA聚合酶能够催化DNA链的合成。
ddNTP是双脱氧核苷三磷酸，其C3位上连的是脱氧后的羟基。在一般情况下，C3位上-OH作为下一个dNTP连接的位点，因此失去氧原子的ddNTP不能与下一个dNTP连接，从而终止DNA链的延伸。
1.用不同颜色荧光标记ddNTP，同时往正常的PCR反应里（分四组，里面加入的是dNTP，引物，DNA聚合酶等等，总之就是正常反应）分别往四个体系中掺入ddNTP（ddATP，ddTTP, ddCTP, ddGTP），也就是每组中只掺入一种ddNTP。
2.当ddNTP结合时，DNA合成终止，因此DNA合成链可能随机停止在任何碱基处。经过几十个循环后，将得到长短不一且长度相差一个碱基的DNA产物，将各组的荧光信号进行比对整合 ，就可以得到相应目的基因的序列。
焦磷酸测序技术:
是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶, 荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列.
反应体系:由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine- 5’-phosphosulfat，APS)、荧光素(1uciferin)。
反应过程:在每一轮测序反应中，反应体系中只加入一种dNTP。如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP,在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在三磷酸腺苷双磷酸酶的作用下发生降解。待上一轮反应完成后，加入另一种dNTP，使上述反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。
高通量测序技术
又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条[DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。
告诉我们哪些基因是活跃的，他们转录了多少。
用RNA-seq来测量正常细胞中表达的水平，然后用它来测量突变细胞中的基因表达
高通量测序的基本流程和原理
https://www.bilibili.com/video/BV1Cx411p7dm?from=search&seid=6688328556232185318
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机理解释文字版：https://www.cnblogs.com/wangprince2017/p/9818071.html
样本准备
1.分离和提纯待测基因
2.利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，（对于RNA 也是相同的处理方法，分离提纯以后将RNA打成小片段，将其反转录为双链DNA）目前除了组装之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打断成200-500bp长的序列片段
3.在这些小片段的两端添加上不同的接头(一是测序的时候需要的引物序列，二是建库扩增时候需要的引物序列)，构建出单链DNA文库。
4.用PCR对文库进行扩增（只有带序列接头的可以被扩增），使得DNA样品浓度足够上机要求。
簇生成
Flowcell支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。
测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。dNTP的3’-OH被化学方法所保护，每次只能添加一个dNTP。
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图片来源于生信星球
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总结
为什么说高通量测序是大样本呢？
因为流动池里面的接头是固定的，所以你不同的基因接好接头以后只要分区块加进去是可以同时扩增测序的。
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