摘要
2019年冠状病毒病（COVID-19）是由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的以飞沫和接触为主要传播途径的传染病。自2019年12月中国武汉出现首例病例以来，疫情逐渐向全国蔓延。截至目前，根据中国卫计委官方公布的数据，新确诊患者人数不断下降，疫情逐渐得到控制。虽然大部分患者感染后症状较轻，预后良好，但也有部分患者发展为严重，多器官并发症而死亡。人类感染SARS-CoV-2的发病机制尚不清楚。免疫功能是抵抗入侵病原体的强大防御手段，目前尚无特异性的抗病毒药物。本文综述了SARS、MERS等冠状病毒肺炎类似SARS-CoV-2的免疫学变化。结合已发表的文献，推断出COVID-19的潜在发病机制，并提出对重症型患者给予大剂量静脉注射免疫球蛋白和低分子量肝素抗凝治疗的治疗建议。
继2003年严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)[1]、沙特阿拉伯和韩国南部爆发中东呼吸综合征(MERS-CoV)后，冠状病毒(CoV)再次成为热点[2]，自湖北省武汉市发生新的冠状病毒并迅速蔓延至全中国等30多个国家以来，冠状病毒(CoV)再次成为热点。截至目前（2020年2月25日），已确诊感染者约80万例，造成2500例以上死亡[3]，急需尽早进行病毒感染的鉴别和干预。虽然核酸检测在病毒基因组序列检测中发挥了最大的作用[4]，但由于核酸检测的过度敏感和对采样的依赖性，在临床上可能会出现一定程度的假阳性或假阴性。尽管对实用的治疗方法或任何可能的药物都进行了多种类型的研究，但目前的共识是没有推荐任何抗病毒药物[5]。目前已证实，免疫系统在防御SARS-CoV和MERS感染中发挥了重要作用。观察SARS[6]、MERS[7]和流感[8]患者的免疫变化，尤其是外周血T淋巴细胞亚群的变化，有助于了解该病的特点、诊断、监测、预防和治疗。
1. SARS的免疫变化
在SARS-CoV感染的急性期，外周血中的淋巴细胞迅速减少[6]，主要是T淋巴细胞减少，CD4+和CD8+ T淋巴细胞均减少。淋巴细胞的丢失甚至先于胸片上的异常变化[9,10]。SARS患者经过1年的随访后，CD3+、CD4+、CD8+ T细胞在疾病恢复期迅速恢复。CD8+ T淋巴细胞，在发病后2-3个月内恢复正常。记忆性CD4+T细胞在发病后1年内恢复正常，而其他细胞计数包括总T淋巴细胞、CD3+细胞、CD4+细胞、CD4+细胞和幼稚CD4+T细胞等仍低于健康对照组[11]。假设病毒感染后，外周血中的淋巴细胞减少首先是由于淋巴细胞封存引起的。恢复期淋巴细胞的增加不是胸腺产生的新细胞，而是外周血与组织或器官之间的淋巴细胞再循环[11]。SARS特异性IgG抗体在急性期晚期约2周左右产生，并随着病程的发展逐渐增加[12]。IgG的持续存在，使患者在感染后获得免疫功能。康复期患者的S蛋白特异性中和抗体反应水平较高且持续存在，可能在决定疾病结局中起着重要作用[13]。轻度患者的IgG水平明显高于重度患者。在疾病进展过程中，患者可伴有IL-8和TNF-α水平的升高，IL-8和TNF-α水平在恢复期早期达到高峰，而MCP-1在急性期早期表现为快速升高，随着病情进展逐渐降低。根据上述研究结果，建议在疾病早期用低剂量糖皮质激素治疗，治疗时间不超过2周，使大多数重症患者的症状得到良好控制[9]。这与其他文献中描述的大剂量糖皮质激素的效果不同[14]。
2. MERS的免疫变化
2012年从一名患者身上分离出一种先前未知的冠状病毒(MERS-CoV)[15]，在家庭型和医院型的暴发疫情中造成了较高的死亡率[2]，与严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)相似。两种病毒的基因组结构非常相似，都是单链正链的RNA病毒，但MERS-CoV和SARS-CoV进入宿主细胞后，MERS-CoV和SARS-CoV分别附着在不同的受体二肽肽酶4(DDP4)和血管紧张素转换酶2(ACE2)上[16,17]。此外，MERS-CoV感染的临床表现与SARS-CoV一样，从无症状感染到重症肺炎伴有急性呼吸窘迫综合征、败血性休克、多器官功能衰竭导致死亡[15]。虽然临床发病机制尚未明确解释，但一项回顾性研究[7]比较了韩国45例患者，认为外周淋巴细胞减少（淋巴细胞减少是指绝对淋巴细胞数低于1 000个细胞/mm3）、血小板减少（血小板数低于15万个细胞/mm3）和CRP水平高可预测肺炎的发展和早期病程中呼吸衰竭的进展。这一结果得到了Min等[18]报道的证据支持。而值得注意的是，MERS感染中的淋巴细胞减少症与SARS患者相比并不显著[19]，研究发现除免疫抑制状态和并发感染外，年龄是唯一的预测因素[20]。
关于MERS-CoV的T细胞反应，在症状发生后两周内（急性期），除了白细胞介素(IL)-6和C-X-C动机趋化因子(CXCL)-8等促炎性细胞因子/趋化因子分泌外[21,22]，在重症/中度患者中观察到MERS-CoV反应性CD8+ T细胞的频率较高，在检测到体液和CD4+ T细胞反应之前，MERS-CoV反应性CD8+ T细胞的频率较高。在恢复期，CD8+ T细胞反应的幅度没有显著增强[22]。这一结果表明，对入侵的MERS-CoV的低效控制带来了强健的炎症反应和CTL反应，而CTL反应在清除病毒中发挥了重要作用。此外，发病后第24天获得的PBMCs显示出对MERS-CoV S蛋白的强特异性T细胞反应[23]。细胞毒性T淋巴细胞（CTL）保护MHV（与SARS-CoV和MERS-CoV同属β冠状病毒组成员）病毒清除的作用也在动物实验模型中得到证实[24]。
Zhao, J等[25]发现，在恢复期，体外测定的中和(PRNT50)抗体滴度可预测感染小鼠的血清保护能力，并与CD4+ T细胞反应相关，但与CD4+ T细胞反应无关。而且在他们的实验中，CD4+ T细胞的表型为效应记忆（CD45RA-CCR7-）细胞，而病毒特异性的CD8+ T细胞种群为半数效应记忆（CD45RA-CCR7-）细胞和半数CD45RA+CCR7-细胞。MERS患者在症状发生后持续和逐渐增加的淋巴细胞反应可能是对抗MERS-CoV的有效免疫反应所需要的，但CTL的周转和这些细胞提供的效应是什么，仍需要进一步研究。
3. 流感中的免疫变化
不同于MERS和SARS的消失，2009年的流感大流行（H1N1）已被纳入季节性菌株。然而，相对于甲型流感病毒（IAV）和乙型流感病毒（IBV）而言，H1N1流感大流行的病死率相对较高[26]，而甲型流感病毒（IAV）和乙型流感病毒（IBV）通常被纳入季节性菌株中[27]。流感基因组包含8个片段，具有抗原漂移和移位两种能力，可分别进行小核苷酸突变和基因组片段交换。由于这些特点，新型抗原在人类中从未出现过，使季节性流行病的发生成为可能。
甲型H1N1感染的表现从亚临床症状到明显的乏力伴发热、肌无力和鼻出血，再到急性低氧血症和急性呼吸窘迫。肺外表现，如胃肠道、神经系统和心脏功能障碍等肺外表现，在综述中也有描述[26]。尽管2009年大流行的H1N1病毒感染和宿主免疫模式不完全，但在早期反应期，血浆中IL-15、IL-8，特别是IL-6水平的升高可能是重症的标志物[28]。另一项研究[28]映射了41名健康志愿者在感染前和感染期间对流感的T细胞反应，并证明流感特异性CD4+ T细胞与人类流感挑战的疾病保护相关。然而，Kristin G.I.Mohn等[8]在急性期和恢复期患者中刺激PBMC，提示急性期患者中流感特异性CD8+与CD4+ IFN-γ T细胞的频率明显低于CD4+，而康复期患者中针对保守的核心抗原的CD4+和CD8+ T细胞的水平都很高。考虑到缺乏足够的样本量和研究设计，在不同的感染期是否存在T淋巴细胞亚群主导地位的差异性还需进一步探讨，但CD4+ T淋巴细胞计数与疾病严重程度有关[28,29]。
值得注意的是，在季节性流感感染中，外周淋巴细胞计数和淋巴细胞亚群与重症患者的预后表现出显著的相关性。有研究将IAV或IBV患者与健康人比较，血清IL-6、IL-8水平升高，CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK计数下降与患者感染有关[30,31]。
据文献综述，SARS-CoV、MERS-CoV、流感病毒等呼吸道感染的病毒均引起周期性暴发和死亡。组织病理学检查显示共同特点：弥漫性肺泡损伤、水肿性肺部病变和肺炎[32-34]。此外，对病毒感染的检查表明，病毒在上呼吸道和下呼吸道的有效复制能力与轻度或中度的临床症状和病理改变有关[33-35]，但仅在MERS-CoV感染的猕猴中，接种后2天内可检测到一过性淋巴细胞减少[33]。Jiang Gu等[36]推测，明显的T淋巴细胞（CD3+、CD4+和CD8+细胞）下降使免疫系统减弱，加重了呼吸道SARS感染的SARS。综上所述，病毒复制、分布及相关免疫反应促进了传染病的进展。外周淋巴细胞的变化和淋巴细胞亚群的转变可能为SARS-CoV-2感染的发病机制提供了新的思路。
4. 假设的发病机制
根据已发表的文献和对COVID-19患者的临床观察，我们对SARS-CoV-2感染人类的发病机制提出了合理的假设。病毒可能通过黏膜，尤其是鼻腔和喉部黏膜，然后经呼吸道进入肺部，再由呼吸道进入肺部。感染的早期最常见的症状是发热和咳嗽[37]。病毒可由肺部进入外周血，引起病毒血症。然后病毒会攻击表达ACE2的靶器官，如肺、心、肾、胃肠道等[38,39]。粪便样本中检测到的SARS-CoV-2的可能性较大[37]，因为病毒从肺部进入血液，然后由血液进入肠道，这支持了我们的假设。王大伟等发现，从症状出现到ARDS的中位时间约为8天[40]。我们推测，在这种情况下，病毒开始二次侵袭，使患者在发病后7-14天左右病情加重。在感染过程中，患者早期外周血中的白细胞计数正常或稍低[37]，出现淋巴细胞减少症[40]。我们推测，可能在疾病早期就会出现B淋巴细胞减少，从而影响患者体内抗体的产生。严重型患者中，淋巴细胞明显减少[40]。我们推测，COVID-19型患者的淋巴细胞可能随着疾病的进展而逐渐减少。但重症型患者淋巴细胞显著减少的机制仍不清楚。此外，以IL-6为主的疾病相关的炎症因子[41]明显增加，这也是发病后7-14天左右病情加重的原因。非生存者的中性粒细胞、D-二聚体、血尿素氮和肌酐水平均高于生存者[40]。
根据上述假设，将临床阶段分为三个阶段：病毒血症期、急性期（肺炎期）和恢复期。如果急性期（肺炎期）患者的免疫功能有效，没有更多的基础疾病，病毒能得到有效抑制，则进入恢复期。如果患者年龄较大，或免疫功能受损，再加上其他基础疾病如高血压、糖尿病等，急性期（肺炎期）患者的免疫系统不能有效控制病毒，就会变成重症或危重型。正如我们在假说中提到的，重症型患者的T细胞、B细胞进一步减少，而炎症细胞因子和D-二聚体继续增加（图1A）。为了提高患者的免疫功能，抑制炎症因子风暴的形成，我们提出了以下两种治疗措施。
图1. COVID-19的假设发病机理。X轴为SARS-CoV-2感染后的天数，根据上述猜想将其分为三个阶段。Y轴为患者体内T细胞、B细胞、炎症因子、D-Dimer和病毒载量的变化趋势。(A)为COVID-19重症型患者各指标的变化趋势；(B)为LWMH和IVIg治疗后的COVID-19重症型患者各指标的变化趋势。阴影区域代表LWMH和IVIg治疗的推荐干预时间。
COVID-19目前没有特异性的抗病毒药物治疗，所以本病的治疗主要以对症治疗和氧疗为主。建议在发病期间监测炎症因子和淋巴细胞亚群。我们建议在T细胞、B细胞、炎症细胞因子和D-二聚体呈现以下趋势时，可尽早给予IVIg和低分子量肝素（LMWH）抗凝治疗。外周血中T淋巴细胞和B淋巴细胞较之前明显降低；炎性细胞因子如IL-6等炎性细胞因子明显增高；凝血指标如D-二聚体异常增高；胸部CT提示肺部病变扩大。在我们的推荐中，可按每天每公斤体重0.3-0.5g的剂量给予大剂量IVIg，连用5天，可早期阻断炎症因子的风暴，增强免疫功能。目前已经启动了一项对严重的SARS-CoV-2感染患者进行IVIg的随机对照临床试验（NCT 04261426）。尽管IVIg在治疗流感患者[42]和SARS患者中显示出疗效[43]，但我们需要更多的COVID-19患者的临床数据作为证据。
尤其是在疾病的早期阶段，建议采用LMWH抗凝治疗。感染是引起播散性血管内凝血的常见原因。炎症、感染等因素可导致凝血功能过度激活。我们在临床上观察到，COVID-19重症型患者可发生播散性血管内凝血（DIC）（未发表数据）。在COVID-19重症型患者中，手指和脚趾可能出现缺血性改变（图2）。当D-二聚体值高于正常上限4倍时，建议对COVID-19型患者进行抗凝治疗，但有抗凝禁忌症的患者除外。LMWH的推荐剂量为每公斤体重100U，每12 h皮下注射一次，至少3-5天。临床医生应密切观察患者的实验室检查指标，警惕抗凝剂治疗后的副作用。
图2. 在一个COVID-19严重型患者的脚趾缺血变化。
综上所述，目前对COVID-19重症型和危重型患者的治疗是控制死亡人数上升的关键。我们建议早期启动IVIg和LMWH抗凝治疗，对改善重症和危重型患者的预后有较好的效果。图1B描述了启动IVIg和LMWH抗凝治疗的最佳时间，以及治疗后T细胞、B细胞、炎症细胞因子、D-二聚体的可能趋势。需要更多的免疫学相关研究来帮助我们了解发病机制，指导疾病的治疗，改善预后。
Lin, Ling, et al. "Hypothesis for potential pathogenesis of SARS-CoV-2 infection——a review of immune changes in patients with viral pneumonia." Emerging microbes & infections just-accepted (2020): 1-14.
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