摘要
背景：ADHD的EEG研究历来都集中于EEG频谱或者事件相关电位上。本研究中，我们探讨了一种替代性框架——EEG微状态（MS）作为一种检查ADHD大尺度皮层动态性的新方法，MS是重复出现地形图模式的聚类。
方法：使用k-means聚类，我们通过比较两个数据集中的成人ADHD患者和神经正常的控制组的MS分段，研究ADHD患者静息态EEG的时空动态性。数据集1包含66名ADHD患者和66名控制组被试，数据集2中包含22名ADHD患者和22名控制组被试，数据集2被用于样本外的验证。
结果：在空间上，ADHD患者和控制组被试显示出等效的MS地形图（典型地形图），表明ADHD患者的原型EEG发生器保存完好。然而，这种一致性伴随着时间动态性上的差异。在组水平上，两个数据集上都发现，ADHD诊断和额中地形图（MS D）上与更长的平均持续时间相关，表明其皮层电发生器可能作为全域皮层动态性的显著吸引子。此外，其时空指标与睡眠障碍相关，而已知睡眠障碍和ADHD有密切关系。最后，在数据集1（较大的数据集）中，我们还发现左-右对角地形图（MS A）时间覆盖范围和平均持续时间减少的证据，这些指标和ADHD得分呈负相关。
结论：总的来说，本研究突出了EEG MS作为ADHD有希望的功能性生物标记物的价值，提供了额外的视角来检查其神经生理机制。
注意缺陷多动障碍（ADHD）的特征表现是与年龄和发育水平不相称的注意力不集中、多动和冲动，这是最常见的精神障碍之一，每20名成人中就有1人患有ADHD。因此，迫切需要了解其神经基础以开发出更好的治疗方案。
最近的文献综述指出，ADHD患者存在静息态EEG活动的异常。ADHD具有高的theta/beta功率比值(theta/beta ratio,TBR)，而在正常的皮层发育过程中TBR是逐渐减弱的，这支持了ADHD是由大脑成熟延迟导致的这一理论。
然而，最近的研究未能复现TBR升高作为ADHD诊断特征的这一发现，元分析的研究同样证实了这个现象。
这些不一致的结果表明，高TBR的ADHD群体只是广泛的异常电活动范围内的一个亚组，这与哌醋甲酯治疗反应以及神经反馈密切相关。在成人ADHD的EEG信号中也可以发现不同的亚组，除了低频节律的过大功率外，还显示出了相反的模式包括alpha频段功率降低和/或高频beta功率过高。因此，ADHD不仅在行为上，而且在电生理上都是高度异质性的。
尽管目前主要使用EEG频谱和/或事件相关电位来研究ADHD，但本研究中，我们提出静息态EEG微状态（MSs）作为另一种分析框架。迄今为止，ADHD的MS分析仅限于事件相关电位的MS；因此，自发静息态EEG仍需进行进一步探讨。MS分析通过将自发EEG建模为一系列重复出现的地形图模式，该方法同时考虑了空间和时间动态两个方面。这可以促进ADHD中更清晰的时空分离，因为MS动态性中任何未发现的偏差都意味着空间上不同的皮层发生器的异常时间激活。尽管仅通过头皮EEG数据的聚类很难确定MS的精确解剖发生器，但它们异常的时间特征仍然表明与典型的皮层动力学有显著的差异。把大脑看作是一个大尺度的动态系统可能是一个有价值的框架。以前的研究已经确定了MS动态性和临床人群的行为维度特征显著相关。例如，额中央地形图的持续时间（D类微状态， MS D）和精神分裂症患者的幻觉呈负相关。有趣的是，由于MS是在宽频带（例如，1-30Hz）信号上采用逐个时间点（即，瞬时的）的方式评估的，因此MS指标可能能够捕获跨EEG频段的独立的或共同的皮层动态性。
为了验证这些假设，使用MS分析了88名成年ADHD被试的静息态EEG，分为两个独立的数据集：测试样本，包含来自荷兰的66名ADHD被试和66名神经正常的控制组被试；重测样本，包含来自瑞士的22名ADHD被试和22名神经正常的控制组被试。
方法和材料
数据集
数据集1：被试。66名ADHD患者（31名女性，平均年龄34.1岁，SD=11.4）和66名控制组被试（41名女性，平均年龄36.5岁，SD=12.4），来自于2001至2018年五月期间，荷兰Research Institute Brianclinics和neuroCare Group Nijmegen的被试。ADHD由简明国际精神疾病访谈或临床医生确认，或者在ADHD评估量表的任意子量表（注意缺陷或多动/冲动）上的得分≥5；本研究只包含成年被试。还使用匹兹堡睡眠质量指数（PSQI）对患者进行睡眠障碍的筛查。被试样本包括三种ADHD亚型，包括40混合型（注意缺陷和多动），23名注意缺陷亚型，和3名多动亚型。
数据集1：采集。使用Brain Resource公司开发的标准化、可靠且一致的程序记录2分钟睁眼EEG信号。使用26导Quickcap，采样率为500Hz，按照10-20国际系统放置电极。接地电极为AFz，参考为平均乳突。电阻均小于5kΩ。在数字化之前进行100Hz的低通滤波，基于Gratton等人的EEG校正方法控制水平眼电和垂直眼电。
数据集2：被试。被试来自于Deiber 等人(2020)的研究，22名ADHD患者（12名女性，平均年龄32.3岁，SD=9.2）和22名控制组被试（14名女性，平均年龄31.1岁，SD=7.3）。ADHD患者从Geneva University Hospital的成人ADHD部招募。实验组和控制组被试都回答了四份临床问卷包括成人ADHD自我报告量表（ASRS）1.1版，ASRS包含18个题目评估青少年和成年人的ADHD症状。
临床诊断基于三个结构化问卷：ADHD Child Evaluation for Adults (ACE+)，法语版Structured Clinical Interview for DSM-IV Axis II Personality Disorders [SCID-II]，和法语版Diagnostic Interview for Genetic Studies (仅心境障碍部分)。被试样本包括三种ADHD亚型，包括16混合型，5名注意缺陷亚型，和1名多动亚型。
数据集2：采集。使用64导Ag/AgCI电极帽（ANT Waveguard）记录3分钟睁眼EEG信号，采样率为500Hz，按照10-20国际系统放置电极。接地电极在Fpz和Fz中间位置，参考电极为CPz。使用eego mylab系统（ANT Neuron）放大电信号，所有电阻小于5kΩ。
预处理
两个数据集预处理流程相同：根据哈佛自动处理流程的默认设置，在Matlab 2018b中使用EEGLAB分析数据。简言之，首先1-100Hz滤波，48-52Hz陷波，去除坏导（SD阈限z=3），使用独立成分分析（通过MARA插件）去除眨眼、肌电等伪迹。最后，使用基于振幅和联合概率伪迹检测方法（SD阈限z=3）来删除1秒时长的EEG坏段。
拟合
对预处理好的数据（数据集1和数据集2）进行1-30Hz带通滤波，平均重参考。对每个数据集的ADHD组和控制组分别评估MS地形图。使用EEGLAB中的Koenig Microstate toolbox。对于每个被试的静息态数据，随机选择2000个全局能量谱峰值，对其进行一种改进的（即，极性独立的）k-means聚类并重复100次。基于不同的聚类数（从k=4到k=7）评估MS地形图（即，聚类中心），首先在被试水平上评估，然后通过最小化地形图之间的平均空间性在被试间进行最优的重新排序。最后，将所有被试（在各自数据集/组别内部）各自的MS地形图进行平均，得到每个聚类总的地形图。通过评估每个被试的地形图与组的总地形图的平均空间相关性，我们发现k=5时，在被试间和数据集间的地形图可靠性最高。
后向拟合
然后，使用Cartool将两个数据集的全局优势地形图拟合到原始EEG上。在这个过程中，通过空间相关分析将时间点分配给聚类标签（即，MS地形图）：每个时间点都分配给与之共享最高绝对空间相关性的地形图。如果空间相关性低于r=0.5的相关阈限，则该时间点标记为未分配。使用7个样本（56.0 ms）的平滑窗口，通过平滑因子10调整中心时间点的相关性，来确保信号的时间连续性。将未达到3个样本（24.0 ms）持续时间的相同标签序列分为两个部分并相应的重新标记，每个部分与其相邻段具有最高的空间相关性。该程序结束后，未分配的时间点被删除，未被标记时间点其z≥3的被试不纳入进一步的分析。导出每个被试的EEG信号标签序列用于计算三个指标。首先，全局解释方差（global explained variance, GEV）是所有分配标签的时间点的全域能量表示（Global field power, GFP）的加权方差之和。该指标用百分比（%）表示。第二，时间覆盖范围（time coverage），标签出现在记录中的时间比例。该指标用百分比（%）表示。第三，平均持续时间（mean duration），标签不间断出现的平均持续时间。该指标以毫秒表示。
在后向拟合后，基于大量未标记的时间点（z分数大于3，数据集1=13%|数据集2=18%）的异常值检测，数据集1和数据集2各筛出一个控制组被试。这些被试被排除在进一步的分析中。
功率谱分析
使用Welch方法计算2-30Hz频段内的绝对功率谱密度。有效的窗口大小为2.048s，没有重叠。为了得到可用于被试间比较的相对指标，将所有值除以全频段之和（2-30Hz）。然后将获得的值在每个频段内相加以进行进一步分析：delta (2–4 Hz), theta (4–8 Hz), alpha (8–12 Hz), low-beta (12–20 Hz), 和high-beta (20–30 Hz)。
注意缺陷和多动的临床指标
对于每个数据集，我们选择了最能反映ADHD当前（即，成人）症状的标准化临床问卷。
数据集1：ADHD评估量表，包含23个4点评分（0=很少或没有，1=有时，2=经常，3=总是）有无症状的问题。ADHD评估量表包括注意缺陷和多动症状两个子量表。
数据集2：成人ADHD自评量表1.1版本，包括18个5点评分（0=从不，1=很少，2=有时，3=经常，4=总是）的题目评估青少年和成人当前的ADHD症状。ADHD自我报告量表包括注意缺陷和多动两个症状的两个子量表。
统计
组间比较上，对于三个时空参数进行非配对的置换检验比较平均数。由于缺乏预先的假设，数据集1采用双尾检验。数据集1的分析结果用来形成数据集2的研究假设，因此数据集2使用单尾检验。通过10000次重复的模拟随机取样估计p值。报告效应量Cohen’s d，即平均数的标准化差异。结果使用Bonferroni方法进行多重比较校正。
对Pearson相关系数使用双尾置换检验（10000次置换）计算MS参数和临床评分之间的相关。
结果
数据集1
MS 地形图。数据集1上，ADHD组和控制组在年龄和性别上没有差异。
我们将MS分段分别应用于两个组别，以识别可能在某个群体中特定的潜在的地形图。我们在ADHD组和控制组中确定了5种等效的地形图（图1），与先前文献中报告的传统的MS地形图相对应：左-右对角线朝向（MS A），右-左对角线朝向（MS B），额后朝向（MS C），额-中最大值（MS D）和顶中最大值（MS F）。空间相关分析显示组间MS地形图的差异可以忽略不计，配对地形图的最小绝对相关为87%。
因此，我们将ADHD组和控制组的EEG信号拼接到一起进行单一的k-means分析，以获得两组被试一套公共的地形图。这些地形图将用于对所有被试的数据进行后向拟合。
图1.数据集1. EEG微状态地形图对比：成年ADHD (n = 66) vs. 控制组(CTRL, n = 66)。(A)ADHD、CTRL和ALL(ADHD+CTRL)三种条件下的五种静息态EEG地形图。(B) ADHD和CTRL之间五种静息态地形图的空间相关系数。
MS 分段
正如图2所示，首先观察到，与控制组相比，ADHD组中MS A上的时间流行率降低：也就是说，相比于控制组，ADHD组被试在该状态中花费的相对时间显著减少(p ≤ .05, d = -0.43)。另外，尽管不显著(n.s.)，但ADHD组MS A平均持续时间要更低(n.s.,d = -0.59)，MS A解释的GEV总量在均数上降低(n.s., d = -0.32)。
有趣的是，在MS D上发现了相反的效应，ADHD组出现时间流行率的相对增加：在ADHD组，MS D的额中地形图平均解释了更大的全局方差（GEV, p≤.01, d = 0.71），增加的时间比例（时间覆盖范围, p≤.05, d = 0.59）和更长的状态持续时间（平均持续时间, p≤.05, d = 0.53）。其他地形图上没有发现显著结果。
MS参数和临床指标的回归分析。根据组分析的显著结果，我们假设MS A和MS D的动态性可能与ADHD的严重性的差异有关。我们评估这两种MS的参数和ADHD患者在ADHD评估量表得分之间的关系。如图3所示，MS A参数和临床ADHD得分存在显著负相关：包括MS A时间覆盖范围和ADHD总分之间，MS A时间覆盖范围和ADHD多动得分之间。还有MS A GEV和ADHD总分，MS A GEV和ADHD多动得分，MS A平均持续时间和ADHD总分，MS A平均持续时间和ADHD注意缺陷得分之间都存在显著负相关。在该数据集中，未发现临床指标和MS D参数存在显著相关。
在ADHD组还发现MS D动态性和PSQI存在相关（图4），其中PSQI得分越高表面睡眠障碍越严重。结果发现，PSQI总分和MS D GEV以及时间覆盖范围都存在显著正相关。
图2.数据集1. EEG微状态（microstate, MS）动态指标对比：成年ADHD (n = 66) vs. 控制组(CTRL, n = 66)。(A)ADHD、CTRL和ALL(ADHD+CTRL)三种条件下五种EEG MS。(B)每个MS的全局解释方差（Global explained variance, GEV）。(C)每个MS的时间覆盖范围（coverage）。(D)每个MS的平均持续时间（Mean duration）。
图3.数据集1. EEG MS参数和ADHD临床评分的相关（只包含ADHD被试，n = 66）。
图4.数据集1. EEG MS参数和ADHD睡眠质量的相关（只包含ADHD被试，n = 66）。匹兹堡睡眠质量指数(Pittsburgh Sleep Quality Index, PSQI)。
数据集2
MS 地形图。第二个复制数据集上，同样的MS分析流程应用于22名成年ADHD患者和22名成人控制组被试。ADHD组和控制组在年龄和性别上没有差异。
我们观察到与数据集1非常相似的地形图（图5），数据集间的最小空间相关性为0.89（图S1）。ADHD组和控制组均呈现出五种经典的MS地形图，MS A, MS B, MS C, MS D, MS F。空间相关分析显著ADHD组和控制组的地形图的差异很小（图4A），对角线最小绝对相关为91%。拼接ADHD和控制组被试的数据后，地形图保持不变。同样的，我们使用了组拼接的MS地形图来后向拟合到数据集1中，评估个体被试层面上的MS动态性。
MS分段。基于数据集1中发现的独立的组间差异，我们假设ADHD组被试MS D参数升高而MS A参数降低。为了测试这一点，我们对MS A和MS D参数的平均数进行了定向（即，单尾）置换检验（图6）。因此，在本节中对六项对比的结果进行了校正。
我们复制了MS D在效应量和统计显著性上的偏差：在ADHD组被试中分配给MS D的时间点显著更长（p=.05, d = 0.77），而GEV（n.s., d = 0.49）和时间覆盖范围（n.s., d = 0.57）也明显（虽然不显著）增加。MS A上未发现显著差异，因此ADHD在MS A上的显著差异未能得到复制（n.s., GEV: d = -0.14| 时间覆盖范围：d = -0.07|平均持续时间：d = 0.42）。
临床相关。基于两个数据集上的组分析，我们只在MS A和MS D上测试了这两者与临床得分之间存在显著相关的假设。对于ADHD组患者没有发现任何ADHD临床得分和MS参数之间的相关。
图5.数据集2. EEG微状态地形图对比：成年ADHD (n = 22) vs. 控制组(CTRL, n = 22)。(A)ADHD、CTRL和ALL(ADHD+CTRL)三种条件下五种静息态EEG地形图。(B) ADHD和CTRL之间五种静息态地形图的空间相关系数。
图6.数据集2. EEG微状态动态（microstate, MS）指标对比：成年ADHD (n = 22) vs. 控制组(CTRL, n = 21)。(A)ADHD、CTRL和ALL(ADHD+CTRL)三种条件下五种EEG MS。(B)每个MS的全局解释方差（Global explained variance, GEV）。(C)每个MS的时间覆盖范围（coverage）。(D)每个MS的平均持续时间（Mean duration）。
功率谱分析
在Bonferroni校正后，不管数据集1还是数据集2都没有发现ADHD组和控制组在EEG频段上存在显著差异（图7）。
图7.ADHD和CTRL的EEG相对功率谱差异。
讨论
本研究旨在探讨EEG MS来作为ADHD潜在的新型功能性生物标志物。通过将该方法应用于成人ADHD患者，我们发现该疾病的新的电生理的特征。为此，我们将空间k-means聚类应用于两个独立的数据集，每个数据集都包括成人ADHD和神经正常的控制组。我们首先观察到ADHD的地形图和普通人群的MS地形图（A、B、C、D、F）密切对应，表明皮层电发生器的空间组织没有很大偏差。这种等效性使我们能够估计每个MS上ADHD和控制组之间是否存在任何统计学上的差异。我们发现额中央地形图（MS D）的平均持续时间统计上显著更长，在数据集1和数据集2中都有中大程度的效应量（分别为d = 0.59和d = 0.77）。第二，第一个数据集中，还发现MS A时间覆盖范围（d = -0.59）和平均持续时间（d = -0.43）下降，这两个指标和ADHD注意缺陷得分呈负相关。
微状态D
有趣的是，MS D在注意任务（如，心算）中被更多的报告；因此，在ADHD组发现MS D更占优势非常令人好奇（也可能是违反直觉的）。然而，在对刺激没有反应的时期（过渡到嗜睡的过程中）也发现MS D更高的时间流行率。与此相反，最近一项研究发现MS D和警觉水平呈正相关。在催眠、幻觉、睡眠和精神分裂患者中都发现了MS D流行率发生变化。鉴于我们的两个数据集中成人ADHD在MS D上更大的流行率和持续时间。因此，我们假设MS D的皮层电发生器可作为皮层动力学的持久吸引子，从而降低其全局可变性或/或复杂性。该解释也与最近的一项综述相一致，该综述认为MS D可能负责反射性注意的某些方面，例如注意焦点的重新定向和转换。
在解剖学上，先前研究发现MS D的额中地形图和右顶-下叶，右额中回额上回以及右脑岛的激活有关。这些脑区被认为是背侧注意网络的一部分。因此我们的发现初步指出该网络内的异常的动态性，并得到了fMRI研究的支持。
与睡眠障碍的关系
有趣的是，我们观察到MS D流行率和ADHD患者更差的睡眠质量显著相关。此前已有研究确立了睡眠障碍和注意缺陷之间的关系。考虑到Ke等人最近的一项研究发现睡眠剥夺个体MS D覆盖范围的增加（MS A覆盖范围减少），本研究的结果更加有趣。他们的研究结果与本研究存在重叠，支持了先前存在的睡眠、多动障碍和异常脑电特征三位一体的假设。
微状态A
在较大的数据集中，我们还发现MS A时间覆盖范围显著降低，这与ADHD组中临床注意缺陷得分呈负相关。最近一项研究表明，提升的警觉状态和MS A相对较少的流行率（以及更长的MS D持续时间）存在相关。因此，本研究发现的较低的MS A覆盖范围和增长的MS D持续时间表明，ADHD可以被描述为一种高警觉状态，这与身体和情绪多动的行为症状一致。
频谱功率差异
经典的EEG功率谱分析频繁发现ADHD临床患者表现出额中地形图慢波（例如，theta）异常。大量研究调查了儿童和成人ADHD的频谱功率差异，然而最终系统性综述报告，可能不存在一致的ADHD特有的静息态EEG异常。这与本文呈现的数据一致，ADHD组和控制组之间相对频谱功率没有显著差异。具体而言，在数据集1中，我们观察到与控制组相比，ADHD组low-beta功率相对降低，而在数据集2中表现出相反的模式。人们可能会注意到使用数据集2得出结果（不同于原始文献中的形式）的重要性。在我们看来，可以从两个方面解释其中的区别：第一，由于MS分析过程中平衡数据集所需的样本量较小，导致统计效力的损失；第二，滤波设置的变化，本研究中滤波带宽为1-30Hz，而原始研究为0.5-40Hz。
因此，MS指标（特别是MS D）可能被证明是ADHD诊断和/或预后的更通用的辅助生物标记物。
结论
总之，据我们所知，本研究首次研究了成人ADHD患者静息态MS动力性。我们通过两个数量数据集证实，MS D和/或MS A有可能是ADHD（或至少其中一个亚型）功能性生物标记物。迄今为止，尽管没有生物标记物被成功用于明确诊断或知道ADHD治疗，但是MS分析在这些人群中的潜在应用可能会被证明是一个额外的有价值的方法，以更好地理解其神经生理学机制。
局限
鉴于本横断研究是被试间设计以及相关分析，无法确定观察到的MS差异实际上是ADHD的原因还是结果。值得注意的是，考虑到不同临床医生和精神病量表，我们的两个数据集之间以及内部的ADHD诊断过程可能有所不同，并且这些诊断方法可能和当前的标准不同，特别是数据集2中没有考虑症状史。因此，发现的MS生物标记物可能不是ADHD的特异性诊断，而是某些行为亚组（例如，睡眠障碍）。
参考文献：Electroencephalographic Microstates as Novel Functional Biomarkers for Adult Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder
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