精子介导基因转移法

方法	显微注射法	胚胎干细胞法	逆转录病毒法	精子介导法
优点	外源基因整合效率较高，不需要载体，目的基因的长度可达100Kb	外源基因整合效率较高，整合在生殖细胞中的比例也很高	基因转移效率较高，可在整合点整合转移基因的单个拷贝	基因转化方法简单，效率高
缺点	需要精密的仪器，技术操作较难，易造成宿主动物基因组的插入突变	ES细胞株不易建立，长期培养后出现分化现象，产生的转基因动物都是嵌合体	插入的基因有大小限度，一般不超过10Kb转入病毒自身的基因表达	成功率不高，效果不稳定

原理：精子介导法Sperm-mediated gene transfer (SMGT)是利用精子头部正电荷可捕获外源DNA(电负性)的特性，将外源目的基因与精子混合孵育，这种精子在受精过程中可将外源DNA导入受精卵，它是动物转基因研究中外源基因导入的一种重要方式，已在小鼠(Lavitramo M，1989)、猪(Horan R，1991)、鸡(Nakanishi A，1993)等多种动物中应用。
在家蚕研究中，Shamila 和Mathavan 曾进行过向幼虫精巢注入外源基因的方式的探讨(Yusulf Shamila，1998)。郭秀洋等(2000，2001)也利用精子携带的方式向蚕卵导入外源基因进行了探讨，结果表明该法可用于家蚕外源基因的有效导入。因该法操作简单易行，不需昂贵设备，对受体卵生理损伤小，且阳性率高。因此，这种方法一经问世就以其操作简便、成本低廉、便于大量筛选等优点而受到人们的重视。

精子介导法的三种方式

方式一（先注后交法）：

将携带外源基因质粒（2000ng/uL）5ul以毛细管玻璃拉成的玻璃针注入处女蛾交尾囊，然后让其与雄蛾交配。检测其所产卵孵化而成的个体是否携带外源基因。

方式二（先交后注法）：

将交配30min 后的雌雄蛾拆对，再由雌蛾交配囊注入携带外源基因质粒（2000ng/uL）5ul然后使其产卵孵化�所得个体为检测对象。

方式三（人工受精法）：

将交配30min 后的雌雄蛾拆对�解剖雌蛾�取出交尾囊中的精液，令其与携带外源基因质粒（2000ng/uL）5ul混匀并注入处女蛾交尾囊以其产卵孵化所得个体为检测对象。

实施案例

1. 利用精子介导法向蚕卵导入外源基因的研究

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在本研究中，以方式一所得阳性蛾区比例及阳性继代率最高，表明经过改进完善，本方式可发展为成熟的行之有效的方法。

2. 转PGH基因蚕构建研究及转GFP和neo～r蚕的继代分析

以精子介导法将质粒pFbPGH和pSMTPGH导入夏秋用蚕品种夏芳。具体操作为：将
5ul（2ug/ul）携带外源基因的质粒以毛细管玻璃拉成的玻璃针注入处女蛾交尾囊，然后让其与雄峨交配。收集处理蛾所产的卵进行饲养检测。

3. 家蚕和蓖麻蚕人工授精初步研究

同品种蚕蛾交配适当时间（家蚕，40-60min、蓖麻蚕5-7h）后，剖取交配囊种的精液，敬业由交配孔注入处女蛾体内。每只处女蛾注入精液体积，家蚕10ul-15ul，蓖麻蚕20-30ul。

4. 外源DNA诱导家蚕遗传变异的研究

外源 DNA 导入家蚕试验DNA导入采用两种方法:是注射法，将DNA用重蒸馏水稀释后，注射到家蚕处女蛾交尾囊内，再与同品种雄蛾近交。二是浸泡法，解剖处女蛾，取出蚕卵后，参照方瑗等的方法4，进行孤雌生殖处理。浸泡时间分别为20-120分钟。

5. 家蚕精子介导转基因技术初探

基因导入方法参照 Guo et al(2001)、Ca0et al(2006)、Zhang et al(2007)的研究方法，将转座子质粒 pBac[3xp3-EGFP+IE1]与辅助质粒 pHA3pBac以1:1混合后，注射入云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究保存的云蚕7A雌蛾交配囊。每只雌蛾注射DNA 4-6μL,浓度为以 0.1XTE 稀释的 2g/L，注射DNA 后的雌蛾与雄蛾交配2小时，拆对产，即时浸酸法处理蚕卵，常规催青收蚁。

6. 家蚕精子介导转基因技术体系的优化
精子细胞的提取及活化

从交配30min的雌蛾种提取交尾囊立即置于TC-100培养基种，用ddH2O冲洗3次去除TC100，挤压、离心获得精液。精液种加入胰蛋白酶和penicillin-streptiomycin，使胰蛋白酶终浓度为 0.4ug/mL、penicillin-streptomycin终浓度为 500 U/mL。

外源基因导入方法

外源DNA为 pPIGA3GFP与 pHA3PIG，其质量比为 1:1，采用下述 3种方法导入外源 DNA。先交后注法：雌蛾与雄蛾交配 30mi后拆对，立即注射 6~8 uL DNA溶液，25 ℃产卵。先注后交法：向处女蛾交尾囊注射6~8uL外源 DNA后立即与雄蛾交配，2 h后拆对，25 ℃产卵。人工授精法：将活化预处理后的精液加入适量外源DNA立即注入处女蛾交尾囊，25℃产卵。常规浸酸催青处理使其孵化。

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其中先注后交的阳性检出率最高，达77.8%。

综合所有试验因素的结果，我们推荐家蚕精子介导基因转移技术的优化技术方案为：处女蛾交尾囊先注射6～8μＬ以0.1×ＴＥ稀释的2ｇ/Ｌ转座子载体ＤＮＡ后正常交配产卵,根据Ｇ0代5龄期及蛾期ＰＣＲ检测标志基因为阳性的蛾区自交,Ｇ1代阳性
个体自交以获得纯合后代。

7. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. by sperm-mediated gene transfer

The plasmid DNA was purified using the EndoFree Plasmid Kit (Qiagen). The gene transfer vector pPIGA3GFP-IE-NEO and the helper plasmid pHA3PIG were mixed at a 1:1 molar ratio to a final DNA concentration of 2.0 lg/ll, mixed with Lipofectamine 2000 (Invitrogen) at a 1:3 mass ratio, and incubated at room temperature for 30 min. Unlike mammals, sperm from male silkworm moths are stored in the female’s bursa copulatrix after mating, and eggs are fertilized only after egg laying [8, 9]. Therefore, the incubated mixture of gene transfer vectors was drawn into a glass needle (diameter, 20–40 lm; Narishige) and injected (3.0 ll/moth) through the vagina (copulatory aperture) (Fig. 2B) into the bursa copulatrix (Fig. 2C) of a newly hatched, virgin female moth. Injected female moths were allowed to mate normally. Copulating moths were separated after 3 h, and the females were allowed to spawn naturally in darkness.

8.转BmKIT3~R基因对家蚕发育与生存率的影响
参照郭秀洋、曹广力等的精子介导法将转基因载体导入蚕卵(品种：高白)。即处女蛾与雄蛾正常交配2.5~3.5h 后，将转基因载体(1μg/μL)和提供转座酶的辅助质粒(1μg/μL)按1:1(V/V)混合，以7μL/头注入的交配囊，产卵后，正常催青、收蚁。

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参考资料：

1. 不同转基因技术的比较