5个单细胞组织解离Tips
实验秘籍
单细胞组织解离可能会由于组织类型、物种、样品年龄、处理环境和其他因素的不同，而变得十分困难，需要在实践中不断优化以达到最佳的结果。康奈尔大学博士候选人Madhav Mantri在一次聚焦免疫学研究的网络研讨会上分享了他关于解离小鼠心脏和回肠样本并用于单细胞基因表达实验的经验，可以总结为如下5个Tips：
1、千锤百“练” 2、择善而从 3、因“材”施策 4、不妨尝试连续酶解 5、红细胞清除要趁早
01 千锤百“练”
Mantri的研究聚焦病毒性心肌炎，即由感染引起的心脏炎症。利用1型呼肠病毒感染的新生小鼠模型，他在感染过程中的多个时间点切除小鼠幼鼠的心脏和肠道回肠组织。
“首先，我必须用模拟老鼠，而不是我将要使用的感染病毒的老鼠做大量的练习，因为我不想把所有的工作放在通过口服灌胃机制感染这些新生幼鼠，然后不使用那些组织进行实验。所以我用相同年龄的模拟幼崽练习，它们的组织大小几乎相同。”
除了使用年龄和组织匹配的模型生物样本外，Mantri还推荐了在使用珍贵的人体样本时如何找到可比较的练习组织。这是生物学研究中的一个两难境地：虽然在使用珍贵的人体样本之前进行练习是必要的，但由于你所拥有的样本数量有限，很难找到真正的人体练习组织，因为它们十分宝贵。
Mantri建议从文献入手，确定目标组织中的细胞外基质（ECM）成分，并了解你所将接触到的捐赠者或患者的年龄。他建议使用与年龄相适应的小鼠组织进行练习：“找到在哪些年龄的小鼠中你能够发现相同的ECM成分，并使用该组织练习解离。”
ECM构成示意图
此外，人类细胞图谱联盟提供了一个对许多不同的人体组织进行编目的数据门户，包括用于单细胞组织解离的protocol。这是一个有价值的工具，可以与审查这些protocol或执行这些protocol的科学家取得联系，因为他们是单细胞实验中研究这些组织类型的专家。
02 择善而从
Mantri介绍了他的实验，从组织收集到Ep管，并记录了样品处理的最佳做法。首先，因为他使用的是新鲜冷冻单细胞RNA-seq试剂盒，他很早就计划了实验，并且对新鲜组织的环境需求很敏感，以优化细胞活力。针对心脏组织，他说：
“我会取出心脏组织，然后把它和冰HBSS溶液一起放在盘子里。然后我会给心脏灌注确保尽可能多地从心室中抽出血液。然后把组织转移到一个新的盘子里，把它切成1毫米见方的小块。在这期间，组织必须保持在冰冷的温度，在冰冷洗涤缓冲液中，不应该在任何时候进入室温。”
“我都是在塑料培养皿上完成的，这些培养皿躺在巨大的冰桶上。”
“我把心脏组织放在一个盘子里洗干净，然后用镊子把它取出来，放入新鲜的溶液中。我会去除大部分HBSS，让组织半干。我不会把它浸在很多液体里，而是在盘子的角落放一点HBSS的液体溶液，把我的组织放在那里，然后用刀片在培养皿上切碎。然后我会用移液管把组织和溶液一起吸进去，然后把它转移到一根Ep管上。这就是为什么我不会（在培养皿中）使用大量溶液的原因，因为在开始酶解之前，我使用台式离心机清洗切碎的碎片。”
对于样本收集和处理来说，练习也是必不可少的，正如Mantri强调的那样，一些组织比其他更难去除，同时还需保持良好的组织质量。例如，动物一被处死，肠道回肠组织就开始消化，这就需要迅速将它们放入冰冷的溶液中。在某些情况下，当组织更坚韧时，比如心脏，在动物体内更容易灌注它们。
03 因“材”施策
酶解是从切碎的组织中释放单细胞的下一个关键步骤，需要根据组织和细胞类型选择恰当的酶和时间。根据Mantri的说法，当涉及到酶解组织时，有一个“最佳点”：“你不能花太长时间来解离组织，因为这会影响你的细胞活力。但加入太多酶也不能太快，因为酶反应也会在对组织不利的条件下发生。”
时间序列实验可以帮助确定在特定的时间反应中使用适量的酶：
“对于较低的时间，你使用较高浓度的酶；于较高的时间，使用较低浓度的酶。你可以用酶浓度和时间历程做一个表。把组织分成不同的试管，然后进行这些反应，最后进行细胞计数，找出你的细胞活力百分比。我一开始是为心脏组织做的，所以我知道我需要至少30分钟的解离。”
不同酶解离能力
Mantri强调，寻找解离的最佳点需要特别注意组织的细胞组成。
“解离是一个细胞类型依赖的过程。不同类型的细胞对压力的耐受性不同。例如，心肌细胞是特定于心脏的细胞类型，必须非常小心地处理，否则你不会得到很好的产量……优化肌细胞和平滑肌细胞的解离非常重要，因为它们死得很快。”
Mantri使用了沃辛顿生化公司提供的数据库，该数据库为酶解作用提供了心脏组织特异性的建议，他强烈推荐给其他人。此外，Mantri建议，如果你想从样本中研究一种特定的细胞类型，比如干细胞，利用商业上可用的工具包来解离感兴趣的细胞类型是有效的。
然而，当相同的组织对酶的需求相互冲突时，解离就会变得更加复杂。例如，Mantri发现回肠组织比最初预期的要复杂：肠道由完全不同于绒毛的细胞类型组成”，这影响了酶反应的效率。此外，肠道组织本身对Mantri在实验中用于其他组织类型的基本试剂PBS和HBSS的某些成分不耐受。“我们用来破坏（肠道）成纤维细胞基质的解离酶不应该含有（胰蛋白酶-EDTA）。但它是用来快速去除肠绒毛的。”在这种情况下，EDTA是一把双刃剑：它能完美地解离绒毛，但抑制了胶原酶的活性，Mantri想用胶原酶来解离肠壁组织，因为胶原酶在溶液中中和了钙和镁离子，而钙和镁离子是胶原酶发挥作用所必需的。
Mantri描述了一种解离肠道和绒毛的方法：
“解离壁组织花了一个多小时。但当我分两步做时，把EDTA和绒毛上皮细胞拿出来，把它们放在冰上，把剩下的壁组织块转移到一个新管子里，把它们彻底洗掉，把EDTA去掉。然后加入胶原酶，补充氯化钙，然后我发现可以在20分钟内完成。”
这些创新是从不断试验和失败中总结出来的。然而，这些经验教训对他和其他人未来的实验来说是无价的。“有时解离相同的组织可能会对试剂有冲突的要求，所以你必须小心，在你开始下一个反应之前，你必须清洗那些以任何方式限制酶反应的东西。”
04 不妨尝试连续酶解
Mantri提供的另一个既能加速解离过程又能确保最佳细胞活力的建议是一种称为“连续解离”的方法。“进行连续解离是一种非常有效的加速解离的方法，但不是通过增加酶的浓度。”Mantri解释说，他首先将切碎的组织放入2ml的Ep管中，在热循环器上以极低的速度混合。他更详细地描述了这个过程：
“在30分钟的解离protocol中，每隔10分钟，我将旋转管下或让它沉淀，从热循环器中取出它，并保持它在壁上稳定。我让大块的组织沉淀下来，取下悬浮液，把它放在冰上的新管子里。如果有一些细胞脱离了组织，在溶液中，我不希望它们不高兴地停留30或40分钟。我希望他们去一个4℃的快乐的地方。所以我会准备一个更大的试管，里面有很多溶液，基本上是很多PBS+BSA，你最终要把细胞重新挂起来。然后，我会用新鲜的酶替换酶，以加快整个流程。如果你使用相同的酶30分钟，酶的活性在解离过程中是不一样的。如果每隔10分钟，换3次酶，就能加速下一轮的解离。解离会更有效，你已经把悬浮状态的细胞取出来，把它们放在PBS BSA溶液中。”
05 红细胞清除要趁早
在单细胞悬浮液形成后，在将单细胞上机之前，还有几个关键的清洁步骤。清洗细胞悬液是很重要的，以清除不需要的细胞或碎片，特别是任何残留的红细胞从组织。Mantri分享了他如何确保干净的细胞悬液：
“我通常使用红细胞裂解缓冲液（ACK裂解缓冲液）来清除红细胞。我想说的一件重要的事情是，如果你要做3到4个洗涤步骤，红细胞溶解越快越好。当红细胞溶解时，它们会将RNA释放到溶液中。如果不是50ml的试管，而是15ml的试管，洗掉任何游离的RNA会有很大的不同。如果你洗得不够干净，溶液中有自由漂浮的RNA，你把它加载到仪器中，这些RNA分子会在液滴中被编码，你的数据中到处都是背景。”
Mantri强调，即使在组织分解开始之前，也必须勤奋地进行清洗步骤，以确保在这些阶段移除尽可能多的不想要的细胞，就像在红细胞分解的这一步一样。
以上就是Mantri关于单细胞实验组织解离经验分享的全部内容，希望对同样开展单细胞实验的你有所启发和帮助。
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