2023年6月，陆军军医大学第二附属医院黄岚教授团队在 Clinical and Translational Medicine杂志上发表了题名为“Single-Cell RNA Sequencing Reveals a Mechanism Underlying the Susceptibility of the Left Atrial Appendage to Intracardiac Thrombogenesis During Atrial Fibrillation”的研究论文。研究人员对来自 3 例持续性房颤患者的左心耳及右心耳样本进行了单细胞转录组测序（scRNA-seq）。结合 Tbx5+/- 房颤模型小鼠及 GST pull-down、免疫共沉淀、体外重组蛋白剪切实验、流体剪切力等实验发现房颤患者心内膜内皮细胞（EECs）抗凝功能降低是左心耳血栓形成易感性的潜在机制，该发现有助于开发针对不同细胞亚群及分子靶点的房颤抗凝疗法。该研究中的单细胞转录组测序服务由博奥晶典提供。
【发表期刊】Clinical and Translational Medicine
【影响因子】10.6
【发表时间】2023年6月
【检测技术】scRNA-seq、GST Pull down、免疫共沉淀、体外重组蛋白剪切实验
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研究背景
房颤（AF）是临床上最常见的心律失常，目前全世界房颤患者约为 3300 万人。房颤导致心房收缩功能丧失及血流动力学异常极大的增加了心腔内血栓的发生风险，造成心源性卒中。研究发现，相比于右心耳，左心耳血栓是房颤致脑卒中血栓的主要来源。然而房颤状态下左心耳血栓发生率明显高于右心耳的原因目前仍不清楚。因此，深入探索房颤时左心耳血栓形成的分子机制，对于房颤患者的精准化抗凝治疗具有重要的临床意义。
02
研究路线
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主要结果
1. 房颤患者的心耳单细胞图谱
研究人员从 3 例接受外科直视手术的持续性房颤患者中收集左心耳（LAA）和右心耳（RAA）组织进行单细胞测序，对筛选得到的 32326 个细胞进行分析，鉴定出 11 类细胞后分别进行 top 基因表达分析及 GO / KEGG 功能富集分析。
2. 房颤患者心耳内皮细胞重新分群及亚群分析
在图谱完成之后，作者关注到了内皮细胞，对内皮细胞重新聚类后鉴定出 8 种亚群，比较了左右心耳 8 个亚群的变化。值得注意的是，EECs 亚群在左心耳的比例显著低于右心耳，KEGG 分析显示凝血级联途径的相关基因在左右心耳间具有显著差异，包括左心耳中 ADAMTS1 上调以及 TFPI 和 TFPI2 的下调。因为该研究中无健康人的对照数据，所以随后作者对比了公共数据库中的健康人左右心房EECs的基因表达情况，最后确定了 ADAMTS1、TFPI 及 TFPI2 在房颤患者左右心耳的差异性表达特征。作者又通过 SCENIC 分析，发现调控血栓前状态差异性基因表达的潜在转录因子。
3. 房颤患者心耳成纤维细胞分析及内皮间质转化拟时序分析
内皮细胞分析完之后，作者又关注到了成纤维细胞，通过细胞比例分析显示多数成纤维细胞分布在左心耳，而马松染色也证实 AF 患者左心耳的组织纤维化程度重于右心耳。左心耳成纤维细胞特异性高表达一些促进纤维化基因（PDGFRL、MFAP5、CILP）和基质重构相关基因（MFAP5、TNFAIP6、PTX3）。在看到成纤维细胞的基因表达特征之后，作者提出了一个疑问，AF 患者左心耳中成纤维和内皮细胞之间是否有潜在分化关系？所以，接下来作者构建了基于内皮细胞、成纤维细胞、和 unknown 细胞之间的拟时序分析，结果发现其中 unknown 细胞大多位于分化中间阶段，结合细胞亚群的轨迹分布及其特征性基因表达发现部分成纤维细胞是在房颤过程中由内皮细胞向间质转化而来的。
4. 房颤患者心耳免疫细胞分析
接下来关注焦点为免疫细胞，研究人员鉴定出了包括巨噬、单核、淋巴和 B 细胞在内的多种免疫细胞。通过比较左右心耳差异发现，右心耳中有更多的单核、淋巴和 B 细胞，而左心耳中有更多的巨噬细胞。此外，右心耳巨噬细胞具有更高水平的编码金属硫蛋白（MT1G，M1TX）的基因，这可能和抑制促炎细胞因子的产生相关。作者对巨噬细胞重分群后，发现 M1 型巨噬细胞在左心耳中的比例高于右心耳，说明在房颤慢性炎症过程中，左心耳中的巨噬细胞发生了促炎表型的转化。
5. 房颤模型小鼠中的 TFPI、TFPI2 和 ADAMTS1 表达
在之前的内皮细胞分析中发现了 TFPI、TFPI2 和 ADAMTS1 在左右心耳的差异表达，为了进一步探索它们之间的关系，该研究先构建了 AF 模型小鼠（Tbx5fl/+; CMV-Cre），通过心电图验证其造模成功，马松染色也观察到心耳纤维化程度明显高于对照组，麦胚凝集素（WGA）染色观察到 AF 小鼠心肌细胞显著肥大。RT-PCR 验证相关基因在 AF 小鼠与窦律小鼠左右心耳组织中的表达情况。免疫荧光也观察到 AF 的心内膜中，TFPI 和 TFPI2 在 RAA 中的表达均高于 LAA。
6. 血流剪切力变化调控心内膜内皮细胞中 TFPI、TFPI2 和 ADAMTS1 表达
瘀血和湍流被认为是房颤过程中 LAA 血栓形成的重要因素，特征是内皮细胞壁面剪切应力的降低，那么血流介导的剪切力降低是否与 LAA EECs 中 TFPI 和 TFPI2 表达水平变化有关呢？作者进行了接下来的探索，首先通过流式分选出 EECs，利用 WB 及免疫荧光验证了 TFPI 和 TFPI2 在房颤小鼠左心耳 EECs 中表达下调，ADAMTS1 的表达上调。为了进一步寻找调控这些蛋白表达差异性的驱动因素，研究人员在体外模拟不同血流状态，在模拟房颤血流瘀滞条件下（2 dyn/cm2），EECs 中 ADAMTS1 表达上调，而 TFPI 和 TFPI2 表达下调，同时 TFPI 和 TFPI2 发挥的抗 FXa 活性也显著下降。作者还进一步检测到剪切应力变化与上述蛋白表达变化存在时间相关性，在 6 dyn/cm2 处理后，所有蛋白的表达与对照组相比无显著差异，而在 2 dyn/cm2 处理 30min 后 ADAMTS1 的时间依赖性上调，且在 50 min 时达到平台期，而随后 TFPI 和 TFPI2 的表达仅在 50-90 min 后才出现下降，说明剪切应力诱导的 TFPI 和 TFPI2 的表达降低可能依赖于 ADAMTS1 上调。
7. ADAMTS1 以直接结合方式剪切 TFPI 和 TFPI2，并抑制其抗 FXa 活性
上述发现说明 ADAMTS1 的上调可能影响了 TFPI 和 TFPI2 的表达降低，那么具体机制是什么？作者又进行了下一步的研究，通过 pull-down 及 Co-IP 实验发现 TFPI 和 TFPI2 与 ADAMTS1 间存在直接相互作用。通过 AlphaFold2 建模并根据蛋白对接评分预测了蛋白质间的潜在结合位点。重组蛋白体外剪切实验结果表明，ADAMTS1 可以以时间依赖的方式剪切 TFPI 和 TFPI2，并抑制其发挥的抗 FXa 活性作用。最后，作者又在体外通过 shRNA 沉默 ADAMTS1 验证了 ADAMTS1 对 TFPI 和 TFPI2 发挥的特异性剪切作用。以上结果说明 ADAMTS1 可以直接剪切 TFPI 和 TFPI2，阻断其抗 Fxa 活性，从而导致局部凝血级联反应失衡，促进心房血栓形成。
全文结论及研究意义
1. 单细胞转录组测序揭示了房颤患者心耳组织细胞组成及左右心耳转录组异质性；
2. 房颤患者左心耳血栓形成易感性与其心内膜内皮细胞抗凝活性因子表达下调密切相关；
3. 血流动力学改变可调控ADAMTS1表达，ADAMTS1发挥剪切作用进而影响EECs抗凝因子TFPI及TFPI2的表达。
该研究首次绘制了房颤患者心耳的单细胞转录组图谱，有助于从单细胞层面深入了解房颤病理生理过程及左右心耳的异质性。研究结果揭示了房颤患者左心耳血栓形成易感性的可能机制，即：EECs 中 ADAMTS1 表达上调和 TFPI/TFPI2 降低导致的局部凝血-抗凝失衡，该机制为房颤患者抗凝治疗提供了新的靶点，给房颤患者抗卒中治疗带来了新希望。
参考文献
Yang J, Tan H, Sun M, et al. Single-cell RNA sequencing reveals a mechanism underlying the susceptibility of the left atrial appendage to intracardiac thrombogenesis during atrial fibrillation.Clin Transl Med. 2023;13(6):e1297. doi:10.1002/ctm2.1297
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