2021年11月25日，Nature Communications在线发表了西北工业大学生态环境学院联合中科院动物研究所等合作完成的题为“Molecular mechanisms and topological consequences of drastic chromosomal rearrangements of muntjac deer”的研究性文章。该研究组装了具有祖先核型的獐（Hydropotes inermis，2n=70），小麂（Muntiacus reevesi，2n=46），雌性和雄性黑麂（Muntiacus crinifrons，2n=8/9）的染色体水平基因组，以及贡山麂（Muntiacus gongshanensis，2n = 8/9）的草图基因组，并结合三维基因组的Hi-C数据，深入研究了麂属物种染色体进化的分子机制，揭示了剧烈的染色体进化对三维染色质结构的影响，并为麂属动物的早期进化提供了深入的见解。
背景
麂属动物是鲸偶蹄目、反刍亚目、鹿科、麂亚科下的一类哺乳动物，属内各物种间染色体数目差异巨大，是研究哺乳动物成种机制和染色体演化的理想模型，从而受到了广泛关注。赤麂（Muntiacus muntjak vaginalis）是迄今发现的染色体数目最少的哺乳动物，雌性仅有6条染色体，雄性7条染色体。黑麂和贡山麂都有8条（雌性）和9条（雄性）染色体，但是它们的核型却不相同。小麂与人类一样，有46条染色体。之前的研究发现麂属动物多变的染色体数目和核型是由鹿科祖先染色体（2n=70）反复串联融合而来，但反复串联融合的分子机制尚不清楚。此外，由于常染色体和性染色体发生融合，伴随倒位等染色体变异事件，黑麂演化出一对新性染色体（neo-sex chromosomes），这是哺乳动物中迄今发现的最年轻的新性染色体，使其成为研究哺乳动物性染色体演化的重要模型。
结果
1. 麂属的系统发育、历史种群变化和染色体融合
本研究采用长reads和短reads测序数据并结合Hi-C数据组装了獐、小麂、雌性和雄性黑麂的染色体水平基因组，以及contigs水平的贡山麂基因组，并联合已发表的赤麂基因组信息，基于基因组的四倍兼并位点（4dTV）和线粒体基因组重建了麂属的系统发育关系（图1a）。通过分化时间的估算，研究发现赤麂和黑麂、贡山麂大约在1-2百万年前发生分化，而黑麂和贡山麂在1.44百万年前发生分化（图1a）。种群历史动态分析发现黑麂、赤麂和贡山麂在聂聂雄拉冰期期间种群数量明显降低，而同时期小麂种群数量没有下降，研究推测由冰期引发的遗传漂变和地理隔离加速了麂属物种染色体融合的固定（图1b,c）。
通过全基因组比对分析也进一步证实了染色体融合是导致麂属染色体数目在种间剧烈变化的主要重排类型（图1d）。串联融合定义为一条祖先染色体的顶端着丝粒与另一条祖先染色体的远端端粒连接，罗伯逊融合定义为连接了两个祖先染色体的顶端着丝粒。根据着丝粒的位置和染色体的同源性，本研究在雌性黑麂中识别出来自祖先核型的28个串联融合和3个罗伯逊融合，并确定了这31个融合事件沿系统发育树的发生顺序（图1a,d）。此外，该研究还发现雌性黑麂与小麂、獐相比，序列一致性在90%以上，这表明，麂属物种的快速核型进化并不伴随着基因组序列的快速进化。
2. 麂属染色体融合对三维染色质结构的影响
为了探究染色体融合对麂属动物三维染色质结构的影响，本研究使用獐、小麂、雄性和雌性黑麂的血液样品进行Hi-C测序。在100kb分辨率下，识别出各物种的A/B区室，将雌性黑麂与雄性黑麂、小麂、獐两两进行比较发现雌性黑麂中有90%的基因组区域没有发生区室变化，说明染色体融合对区室的影响较小（图2a）。
在40kb分辨率下，识别出各物种的拓扑关联结构域（TADs）。通过比较雌性黑麂与其他物种的TADs，发现雌性黑麂和雄性黑麂、小麂、獐的TADs分别大约有72.5%72.7%、63.7%65.4%、43.3%~49.2%是保守的（图2b），这说明随着分化时间的增加，不同物种间TADs的保守性降低。此外，本文进一步获得了316个黑麂特有的TADs，通过分析这些TADs中的bins与最近融合位点之间的距离时发现这些bins几乎均匀分布在染色体上，且不在融合位点附近富集（图2b），表明染色体融合对TADs的影响也很小。
在20kb分辨率下，本文分析了不同麂属物种之间的显著相互作用，发现与小麂相比，雌性黑麂中几乎所有跨越融合位点间的显著相互作用都是新建立的，而没有跨越融合位点的显著相互作用只有44.43%是特有的（图2c），这说明染色体融合可能是这些新的显著相互作用的主要驱动因素。同时本研究还发现雌性黑麂中的显著相互作用大多数仅跨越一个融合位点（图2d），这些显著相互作用的数量与融合位点的年龄呈正相关（图2e），并且在互作矩阵热图中也可以直接看到类似的关系（图2f），例如在最古老的融合位点上的互作频率和基因组其他区域相同。
总的来说，染色体融合事件对区室和TADs的影响较小，但它们可以导致新的显著相互作用的产生，从而连接远端基因组位点或跨融合位点，这可能在麂属的进化和适应过程中具有细胞和形态学意义。
3. 麂属染色体融合的分子机制
为了分析麂属染色体融合可能的分子机制，本研究提出了两种假设：1）某些麂属特异性重复序列通过非等位同源重组介导了串联融合；2）调控基因组稳定性的相关基因突变可能促进麂属染色体的快速进化。之前的研究发现，顶端端粒、卫星II (satII)、卫星IV (satIV)和卫星I (satI)重复序列依次排列在小麂染色体的端粒区，并且在赤麂中少数融合位点上satI和端粒重复序列相邻。因此为了检验假设一，本文首先比较了小麂、黑麂和贡山麂以及近缘物种麋鹿（Elaphurus davidianus， 2n=68）中同时包含satI和端粒重复序列（satI-telomere）的三代reads，发现在黑麂和贡山麂中大多数的satI-telomere是相邻的，而在小麂和麋鹿中大多数的satI-telomere距离较远（图3a）。为了探明这种现象的原因，本文比较了包含三种不同卫星序列和端粒序列的三代reads随端粒序列长度的密度分布，发现在包含相邻satI-telomere的reads中，端粒序列的长度是分散的，而在包含距离较远的satI-telomere的reads中端粒序列长度分布集中在小麂的38bp处（图3b），这远短于所有端粒序列的平均长度（667bp），并且这三种截断端粒序列只在小麂中大量存在（图3c）。这些结果表明，包含相邻satI-telomere的reads可能来源于融合位点，而包含距离较远satI-telomere的reads可能来源于祖先端粒染色体的着丝粒区域。进一步的研究发现在包含satI或satIV的reads中，约90%的截断端粒重复序列被回文序列所包围。回文序列构成了基因组中的脆弱性位点，该处发生DNA断裂后，一条祖先染色体的短端粒类似序列很可能会与另一条祖先染色体的端粒序列发生非等位的同源重组，导致了两条祖先染色体的融合（图3d），从而阐明了麂属物种进化过程中由一个复杂重复序列结构（包含一个短的端粒类似序列，两侧有回文序列，再两边分别是鹿科I类和IV类卫星序列）介导的染色体串联融合机制。
为了检验假设二，该研究通过比较基因组学的方法，发现在黑麂、贡山麂和赤麂这三种发生了大量染色体融合的麂属物种中，有很多与染色体稳定相关的基因发生了快速进化或受到达尔文正选择（图3e）。这些基因的改变可能与重复序列结构共同促进了麂属物种的染色体融合，也可能对融合后的染色体有稳定作用。
4. 黑麂新性染色体的进化
为了系统地研究黑麂中的新性染色体，该研究组装出了黑麂的新性染色体，即neo-X和neo-Y染色体，并识别出了在雄性黑麂中 375 Mb的neo-Y倒位区和在雌性黑麂中378mb的neo-X同源区。通过比较neo-X和neo-Y倒位区的多种序列特征（图4a），发现形成于约1.5百万年前的neo-Y染色体倒位区有97%的序列都比对到了neo-X染色体上，这说明neo-Y染色体有了初步的退化，但退化速度较慢。为了检测黑麂雄性特有的单核苷酸多态性位点（SNPs）、插入缺失（indels）位点和结构变异（SVs）位点，该研究利用多个黑麂和贡山麂个体的重测序数据进行分析，发现大多数（66.46%）黑麂雄性特异性突变位于neo-Y区域（图4b），并且这些特异性突变的密度分布揭示了neo-Y染色体上两次倒位的顺序（图4c）。深入研究这些黑麂雄性特异性突变还发现它们导致了neo-Y倒位区内高密度的氨基酸非同义替换以及破坏了部分基因的开放阅读框（ORF）。最后，通过比较黑麂雌性和雄性的三维染色质结构，发现在neo-Y染色体区域聚集了大量区室的转换（图4d），且这些转变已经影响了其内部的基因表达水平（图4e）。相比之下，黑麂雌性和雄性基因组之间的TADs不存在显著差异，TADs在neo-Y染色体区域中仍然高度保守。这些结果表明，早期的新Y染色体在序列水平上的退化现象较少，基因表达调控的退化可能发生在大尺度的染色质结构水平上。
讨论
总的来说，本研究组装了多个麂属动物和獐的高质量基因组，并结合三代测序数据和Hi-C数据，探索了染色体融合可能的分子机制以及染色体融合过程中三维染色质结构的变化。该研究的结果阐明了由一个复杂重复序列结构介导的染色体串联融合的机制，揭示了麂属动物进化过程中染色体重排对区室和TADs结构的影响较小，但对显著相互作用的影响较大，并初步探明了黑麂性染色体的早期进化。这些结果为未来麂属物种进化的相关研究提供了新的思路。
参考：
https://mp.weixin.qq.com/s/BxE32Sni_JAsDmwbjTWhKA
https://mp.weixin.qq.com/s/C7JHuO3HQ53wPduikkRgvQ
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