抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）是免疫系统对抗病毒感染及肿瘤疾病的一种重要免疫防御机制。前面几篇文章详细介绍了单抗药物和ADCC的结构基础和原理，今天讲一下如何建立筛选单抗药物的体外实验方法。
ADCC
开始前，再来看一下ADCC的原理。抗体通过与靶细胞表面抗原特异性结合，招募如自然杀伤（Natural killer, NK）细胞等效应细胞杀死靶细胞。NK细胞表面表达FcγRIIIa蛋白，是一种抗体Fc区域的受体，能识别并结合抗体的Fc端，从而使NK细胞结合到靶细胞周围。一旦Fc受体与抗体的Fc区域结合，NK细胞就会释放细胞因子和细胞毒性颗粒，进入靶细胞触发细胞凋亡。
整个过程有三个重要组成部分：单抗药物、效应细胞（NK细胞）和靶细胞。
因此，体外实验一般包括靶细胞的确定（细胞表面高表达单抗识别抗原）、效应细胞的选择和靶细胞活性的检测。本篇重点讲述效应细胞的选择和靶细胞活性的检测方法。
效应细胞的选择
通常选择PBMC（外周血单核细胞）作为效应细胞。也有从中纯化NK细胞作为效应细胞的。该方法的效应细胞较难获取，且方法变异性大、操作繁琐。
PBMC价格不菲是一方面，批间重复性是更大的问题——如果想获得有重复性的实验结果，最好买同一批次的细胞。
另一个选择是NK92细胞，可以在ATCC上购买，还有稳定表达FcγRIIIa受体（V158高亲和力突变体）的NK92MI。也可以买来细胞自己进行基因改造。
还有一种生物发光报告基因检测方法，采用基因工程改造的Jurkat细胞作为效应细胞，该细胞稳定表达FcγRIIIa受体（V158高亲和力突变体）和由NFAT应答元件驱动表达的萤火虫萤光素酶。抗体与效应细胞表面的受体结合后，激发细胞内NFAT反应元件，NFAT反应元件驱动萤火虫荧光素酶的表达。荧光素酶活性可以通过生物发光进行定量。采用这种方法简单方便，连靶细胞都省了——缺点也在于此，该体系不能反应抗体在体内的真实作用。
还有一种HTRF方法直接检测抗体与FC受体（CD16）的结合能力，可视为单抗体外筛选，或者是优化FC段的高通量方法，目标不在于检测ADCC活性。
靶细胞活性检测
除了报告基因和HTRF方法可以直接检测抗体与效应细胞或者FC受体的结合之外，采用NK92细胞或者是PBMC作为效应细胞的方法，都需要再进一步检测效应细胞引起的靶细胞的死亡。
最传统也是最为经典的方法是铬51标记/释放法。
51Cr release assay
铬51与靶细胞孵育，铬51会进入靶细胞，没有进入的铬51被洗掉，再将靶细胞和效应细胞以及抗体共同孵育，如果靶细胞被杀伤，铬51就会被释放出来，检测溶液中的放射性同位素即可确认靶细胞被杀伤的情况。该方法是ADCC检测靶细胞被杀伤的金标准，不过也有越来越多的非放射性方法被开发出来。
PE公司的 DELFIA®cell cytotoxicity assay kit利用了一样的原理用荧光的方法来检测靶细胞的死亡。首先可以自由扩散入细胞的BATDA被装载入靶细胞，并被活细胞分解成不能够跨越细胞膜的TDA，从而固定在靶细胞内。
labeling
当细胞与效应细胞等共同孵育后，加入检测试剂Eu，细胞被杀伤释放出的TDA可以和Eu结合从而产生荧光。如果细胞没有被杀伤还是完整的，就没有TDA释放出来可以和Eu结合了。这样就可以定量死亡的靶细胞了。
release→Fluorescenct
类似的还有calcein-AM，calcein-AM本身没有荧光而且很容易地进入活细胞，进入活细胞后就变身成强荧光的calcein，若细胞被杀伤，荧光信号就可以在胞外被检测到。
Calcein-AM release assay
Makiko Yamashita等人2015年发表了一篇文章，介绍了一种高效的利用流式细胞术来定量ADCC杀伤靶细胞的方法。他们使用的是双重染料：CFSE标记靶细胞，FVD标记死细胞。
CFSE label
上面介绍的几种方法都是根据细胞膜的完整性来检测细胞是否被杀伤的，采用同样原理的LDH法也可用于靶细胞的活力检测。此外，一些通用的检测细胞活力的方法，如MTT法、CCK8法等等，也可以作为细胞存活率的指征。不过，因为ADCC反应中不光有靶细胞还有效应细胞，而效应细胞往往还是靶细胞的很多倍，它们的活力状态也会干扰对结果的判断。
参考资料：
1. Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC)
2. ADCC
5. Measuring Cytotoxicity by BioluminescenceImaging Outperforms the Standard Chromium-51 Release Assay
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