光绪三十四年（1908）十月二十一日酉时（下午5时至7时），光绪帝驾崩于西苑（今中南海）瀛台涵元殿，年仅38岁。
戊戌变法时，袁世凯辜负了光绪帝的信任，向慈禧太后告密，从而导致变法失败，光绪帝被软禁。袁世凯担心慈禧死后，光绪帝会清算他的罪状，便借进药的机会，暗中毒死了光绪帝。他回忆道：“我还听说一个叫李长安的老太监说起光绪帝之死的疑案。照他说，光绪帝在死的前一天还是好好的，只是因为用了一剂药就坏了，后来才知道这剂药是袁世凯叫人送来的据说光绪帝临终前一语不发，用手指在空中画了“斩袁”两字，含恨而死。
当代国学大师启功曾听闻其曾祖父溥良讲述慈禧和光绪帝先后崩逝一事，他回忆道：“西太后（慈禧）得的是痢疾，所以从病危到弥留的时间拉得比较长……就在宣布西太后临死前，我曾祖父看见一个太监端着一个盖碗从乐寿堂出来，出于职责，就问这个太监端的是什么，太监答道：‘是老佛爷赏给万岁爷的塌喇。' ‘塌喇’在满语中是酸奶的意思。当时光绪帝被软禁在中南海的瀛台，之前也从没有听说过他有什么急症大病，隆裕皇后也始终在慈禧这边忙活。但送后不久，隆裕皇后的太监小德张（张兰德）就向太医院正堂宣布光绪帝驾崩了。接着这边屋里才哭了起来，表明太后已死。”
光绪帝的死是属于虚痨之病日久，五脏俱病，六腑俱损，气血两亏，阳散阴固而死
光绪帝死于疾病似乎无疑，但是一位叫作屈桂庭的西医撰写文章，自称曾入宫为光绪帝诊病，他说在光绪三十四年（1908）十月十八日最后一次进宫为光绪帝诊病时，发现光绪帝原本已逐渐好转的病情却突然恶化，肚子剧痛，不过三天光绪帝便驾崩了。然而屈桂庭入宫诊病一事未见有档案记载，现存档案仅有屈永秋为光绪帝诊病的记录。不知屈桂庭和屈永秋是否为一人？
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