Clinical significance of FAT1 gene mutationand mRNA expression in patients with head and neck squamous cell carcinoma
头颈部鳞状细胞癌患者的FAT1基因突变和mRNA表达的临床意义
发表期刊：Mol Oncol
发表日期：2021 Dec 22
DOI: 10.1002/1878-0261.13171
期刊相关信息
一、背景
头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第六大最常见的癌症，包括所有发生在口腔、口咽、喉和下咽粘膜的癌症。影响HNSCC患者预后的各种分子标志物正在被积极识别，用于精准医疗和个性化治疗。然而，还有许多其他分子标记需要研究。
人类FAT1基因编码一种大型跨膜蛋白，具有细胞外钙粘蛋白重复序列、EGF样结构域和层粘连蛋白G样结构域，通常在上皮组织中表达。Ena/VAPS与FAT1的结合促进细胞迁移。另一方面，Scribble与FAT1的结合抑制了YAP1相关的细胞增殖。FAT1还抑制Wnt/β-catenin信号传导，这对细胞增殖和肿瘤生长很重要。由于FAT1在调控肿瘤发生方面的复杂性，其功能仍不清楚。FAT1的功能是肿瘤抑制器或启动子起作用，取决于癌症的种类。此外，FAT1的突变和低表达是HNSCC患者预后不佳的独立预测因素。通过突变使FAT1失活，可促进Wnt信号传导和不同部位的肿瘤发生。
有研究发现FAT1突变与HPV阴性[HPV(−)]HNSCC患者的预后改善显著相关。此外，FAT1高表达的患者在HNSCC中预后较差。因此，需要进一步的研究来验证FAT1在HNSCC中的作用，并确定HNSCC患者的个性化治疗。
二、材料与方法
1.数据来源
1）TCGA队列（n = 566）的基因表达和临床数据
2）莱比锡队列，GSE65858，n = 270
3）FHCRC队列，GSE41613，n =97
4）MDACC队列，GSE42743，n =74
5）共对72名接受治愈性治疗并接受基因分析的患者进行了前瞻性随访（KHUMC队列，n = 72）
2.实验流程
1）核酸的分离、实时定量反转录酶PCR分析、质量控制检查和转录组测序
2）FAT1特征的鉴定：计算每个基因在FAT1突变组和野生型组之间的倍数变化（FC），以确定不同表达的基因；皮尔逊相关法被用来确定FAT1和其他基因的RNA表达水平之间的相关性；用cluster 3.0进行了分级聚类分析，以中心相关系数作为相似性的衡量标准，并采用完全联结聚类法；根据患者聚类分析的结果，将患者分为两个亚组，即FAT1相关的低风险（FAT1-LR）和FAT1相关的高风险（FAT1-HR）
3）预测模型的构建和四个独立队列的验证：采用贝叶斯复合协变量预测器（BCCP）等级预测引擎来测试基因特征在另外四个独立队列中预测患者等级的能力
4）统计学分析：生存分析、单变量和多变量的Cox回归模型
5）细胞系培养、siRNA 构建和转染、蛋白质印迹、γ-H2AX免疫荧光染色、通过流式细胞仪检测细胞死亡、液滴数字PCR拷贝数检测、克隆发生的存活试验
三、实验结果
01 - FAT1相关基因特征的开发与验证
在各种癌症中，FAT1的改变频率在HNSCC中最高（图S1）。在TCGA HNSCC队列中，FAT1突变患者的FAT1 mRNA表达率低于FAT1野生型患者（图S2A）。为了区分FAT1野生型和突变型患者，对FAT1的表达水平进行了接收操作特征（ROC）曲线分析，得出的曲线下面积（AUC）为0.659（图S2B）。在TCGA HNSCC队列中，FAT1低表达和高表达亚组之间的五年OS和RFS率没有明显差异（图S2C,D）。此外，在TCGA HNSCC队列中，FAT1野生型和突变型亚组之间的5年OS和RFS率没有明显差异（图S2E,F）。
图S1 泛癌中FAT1的改变频率
图S2 TCGA HNSCC患者的FAT1 mRNA表达和突变情况
因此，为了同时探究与FAT1突变和mRNA表达相关的特征，作者确定了与FAT1 mRNA表达相关的重叠基因，这些基因在TCGA HNSCC队列中的FAT1野生型和突变型亚组之间有差异表达。这23个基因的表达与FAT1的mRNA表达和突变密切相关，被选为FAT1特征。FAT1特征被用来构建预测模型。利用FAT1特征，进行了分层聚类分析，用中心相关系数作为相似性的衡量标准，并采用完全联系聚类方法。根据FAT1特征，训练数据集（TCGA队列，n= 566）中的患者被分为FAT1-LR（n = 195）和FAT1-HR（n = 371）亚组（图1A）。FAT1-HR亚组的FAT1突变率明显高于FAT1-LR亚组。此外，FAT1-HR亚组的FAT1 mRNA表达明显高于FAT1-LR亚组。Kaplan-Meier分析和log-rank检验结果显示，在TCGA队列中，FAT1-HR亚组的5年OS和RFS率明显低于FAT1-LR亚组（图1B，C）。
使用四个独立队列验证了23个FAT1特征。根据BCCP分类器，FAT1特征有效地将四个独立队列中的每个队列分为FAT1-LR和FAT1-HR亚组，这与TCGA训练数据集获得的结果一致。根据FAT1特征对每个测试数据集中的患者进行分类，显示FAT1-HR亚组的预后比FAT1-LR亚组差（图1D-G）。在莱比锡、FHCRC和MDACC队列中，FAT1-HR亚组的五年OS率明显低于FAT1-LR亚组（图1D-F）。此外，在KHUMC队列中，FAT1-HR亚组的五年RFS率往往低于FAT1-LR亚组，但差异没有统计学意义（图1G）。这些结果支持FAT1特征在所分析队列中的预后价值。
图1 TCGA队列和四个独立验证队列中HNSCC患者的分层聚类结果
为了评估HNSCC患者的独立预后因素，作者利用患者的人口统计学、社会史和临床分期以及FAT1特征对总共5个队列（n =1079）中的患者进行了单变量和多变量的Cox比例风险模型。FAT1特征（FAT1-HR与FAT1-LR亚组）、年龄（>60岁与≤60岁）和晚期T阶段（T3和T4与T1和T2）是HNSCC患者OS的独立预后因素。在五个独立的HNSCC队列中，FAT1特征（FAT1-HR与FAT1-LR亚组）也是HPV（-）患者OS的独立预后因素。此外，FAT1特征和酒精史（有与无）是HNSCC患者RFS的独立预后因素。只有FAT1特征与HNSCC患者的OS和RFS明显相关。
02 - FAT1特征与HNSCC的HPV状态的关系
为了评估FAT1特征与HNSCC的临床和病理特征的关联，作者比较了五个HNSCC队列中的FAT1-LR和FAT1-HR亚组（n = 1079）。肿瘤部位在FAT1-LR和FAT1-HR亚组之间有明显的不同（口腔44.47% vs. 67.47%；口咽31.54% vs. 11.51%）。此外，FAT1-LR亚组的HPV阳性率明显高于FAT1-HR亚组。对五个HNSCC队列的470名患者的HPV状态进行了检查。在HPV（+）HNSCC患者中，FAT1-LR和FAT1-HR亚组的5年OS率没有明显差异（图2A）。然而，在HPV（-）HNSCC患者中，FAT1-HR亚组的5年OS率明显低于FAT1-LR亚组（图2B）。在FAT1-LR和FAT1-HR患者中，HPV（+）和HPV（-）亚组的5年OS率没有明显差异（图2C,D）。
图2 HNSCC患者中FAT1特征与HPV的关系
03 - FAT1特征与放射治疗结果的关联
在接受放疗的HNSCC患者中，FAT1-HR亚组的5年OS明显低于FAT1-LR亚组（图3A）。然而，在没有接受放疗的患者中没有观察到五年OS的差异（图3B）。同样，在FAT1-LR亚组中，接受放疗的患者的预后好于未接受放疗的患者（图3C）。在FAT1-HR亚组中也观察到这种现象（图3D）。为了确定FAT1特征与HNSCC的放疗之间的任何相关性，对OS进行了交互检验，结果显示FAT1特征与放疗之间有显著相关性。还进行了单变量和多变量的Cox分析，以评估FAT1特征是否是放疗的HNSCC患者的独立预后因素。在包括性别、年龄、社会史、临床分期和FAT1特征在内的各种因素中，FAT1特征是接受放疗的HNSCC患者唯一的独立预后因素。
图3 FAT1特征与HNSCC患者放疗的关系
04 - FAT1特征与HNSCC患者临床阶段的关联
FAT1-LR和FAT1-HR亚组之间的临床分期（I/II期与III/IV期）没有明显差异。作者分析了FAT1-LR和FAT1-HR亚组在早期（I/II期）和晚期（III/IV期）HNSCC的预后情况（图4）。在早期HNSCC患者中，FAT1-LR和FAT1-HR亚组之间的预后没有明显差异（图4A，C）。然而，在晚期HNSCC患者中，FAT1-HR亚组的5年OS和RFS率明显低于FAT1-LR亚组（图4B，D）。
图4 FAT1特征与HNSCC患者临床分期的关系
05 - FAT1 特征与放射灵敏度之间的关联
为了进一步了解FAT1特征与放疗的关系，作者利用癌症细胞系百科全书获得了15个HNSCC细胞系的遗传信息，并利用FAT1特征将细胞系聚类为FAT1-LR和FAT1-HR（图S4A）。其中，HSC3和YD38细胞被选为FAT1-HR亚群，通过各种方式观察这两个细胞系的辐射反应。首先，用实时定量反转录酶PCR分析证实了两个siRNA（siFAT1#1和#2）在HSC3和YD38细胞中的沉默效率（图S4B）。其次，为了证实FAT1控制导致的辐射敏感性的变化，在不同剂量的辐照下对HSC3和YD38细胞进行了集落形成试验（CFA）。如克隆生成生存曲线所示，siFAT1 #1-或#2处理的细胞比siGFP处理的细胞对辐射更敏感，就HSC3和YD38（图5A）而言。随后，测量了用siFAT1s或siGFP处理后的HSC3和YD38照射的S139磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）的水平，它是DNA损伤的指示。当siFAT1s-或siGFP处理的细胞被照射4Gy时，发现siFAT1s处理的细胞的γ-H2AX水平明显高于siGFP处理的细胞（图5B）。在同一条件下，作者用免疫荧光染色法确认了γ-H2AX病灶的形成（图S4C,D）；在计算细胞核中的γ-H2AX病灶时，与siGFP处理的细胞相比，在4Gy照射下，siFAT1s处理的细胞中的病灶明显较多（图5C）。此外，为了研究FAT1的调控对HSC3和YD38细胞的辐射敏感性的影响，用Annexin V和PI联合染色来检查细胞的死亡率。如图5D所示，当HSC3和YD38细胞被辐照时，siFAT1#1-和FAT1 #2处理的细胞的死亡率与未被辐照的细胞相比，都增加了约3至4倍。特别是，在siFAT1 #2+辐照处理组中，HSC3细胞的死亡率为87.7%，YD38细胞的死亡率为33.0%，而在siGFP+辐照处理组中，细胞死亡率分别为7.5%和10.1%。正如前面的结果所预期的那样，证实了细胞死亡在辐照后呈指数级增长（图5D）。
图5 FAT1是调节HNSCC放疗敏感性的一个关键因素
图S4 在FAT1-HR HNSCC细胞系中，FAT1是维护修复放疗引起的DNA损伤的一个关键因素
06 - FAT1特征在HNSCC中对放射电阻的关键作用
作者在获得辐射抗性的HNSCC细胞系中研究了FAT1与放疗抗性之间的关系。使用图6A所示的方案，建立了一个高度抗辐射的HNSCC细胞系，CAL27-RR。已经证实，CAL27-RR细胞比CAL27-P细胞具有更强的抗辐射能力。作者对CAL27-P和CAL27-RR细胞系进行了一式三份的RNA-seq，并进行了分级聚类分析，用中心相关系数作为相似性的衡量标准，并使用FAT1特征的完全联系聚类方法。这些样本被清楚地划分为CAL27-P（n = 3）和CAL27-RR（n = 3）亚组（图6B）。为了确定FAT1的表达在头颈癌细胞获得辐射抗性时是否会发生变化，确认了FAT1在母癌细胞、CAL27-P和CAL27-RR细胞中的表达。如图6C所示，作者确认与CAL27-P细胞相比，FAT1在CAL27-RR细胞中被上调了。依次用siGFP转染的CAL27-P、siGFP转染的CAL27-RR和siFAT1转染的CAL27-RR进行CFA，以确定放射性抵抗的任何变化。正如预期的那样，获得放射性抵抗的CAL27-RR细胞对辐射的敏感性低于CAL27-P细胞，沉默FAT1可以逆转CAL27-RR细胞对辐射暴露的抵抗表型（图6D）。此外，当CAL27-P、CAL27-RR和siFAT1转染的CAL27-RR细胞被4Gy辐射照射时，CAL27-RR细胞的H2AX磷酸化水平下降，但与CAL27-P细胞相比，FAT1沉默的CAL27-RR细胞明显增加（图6E）。此外，在4Gy的辐照下，CAL27-RR细胞的细胞死亡率也下降了，但与CAL27-P细胞相比，FAT1沉默的CAL27-RR细胞的细胞死亡率上升了（图6F）。
图6 FAT1调节HNSCC的放疗敏感性
07 - HNSCC患者FAT1特征与放疗反应的关系
根据前面的实验结果，通过测定放疗后复发和未复发的HNSCC患者中FAT1相关基因的mRNA水平，验证了利用RNA-seq数据确定的FAT1相关基因的可靠性。23个FAT1相关特征的mRNA水平，以及FAT1基因用ddPCR进行分析，其测量单位是每微升输入cDNA的拷贝数。结果发现，放疗后复发的HNSCC患者的FAT1 mRNA表达明显高于未复发的患者（图7）。FAT1特征基因中的9个基因（TCEA3、PCDHGA10、PCDH7、DSCAM、F2RL1、SYNGR1和CYP2E1）在放疗后复发组的表达明显高于非复发组（图7）。
图7 FAT1相关特征的mRNA表达可用于预测HNSCC患者的放疗反应
08 - 通路分析
将FAT1特征基因提交给DAVID，以发现具有明显富集基因数的基因本体类别。用Fisher's精确检验确定P值小于0.05的基因注释的意义。用DAVID对总共23个FAT1特征基因进行分析，确定了一条重要的REACTOME途径为：R-HAS-21099A（Basigin相互作用）途径（相关基因=SLC16A8，SLC7A11）。
四、结论
在本研究中作者开发了FAT1特征，在预测HNSCC患者的预后方面发挥了重要作用。同时，FAT1特征与HNSCC患者对放疗的反应、晚期阶段和HPV状态有关。因此，FAT1特征可能有助于为更详细分类的 HNSCC 患者设计个性化治疗。
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