作者，追风少年i
周四了，马上一周又要过去了，今天呢，分享一篇文章，文章在Spatially resolved multi-omics deciphers bidirectional tumor-host interdependence in glioblastoma,空间多组学分析破译胶质母细胞瘤,值得我们研究一下。不得不说现在的研究都是以大样本量著称。
Graphical abstract
summary，肿瘤细胞的异质性是由于局部环境的异质性
胶质母细胞瘤是中枢神经系统的恶性肿瘤，其特点是亚克隆多样性和发育等级中的动态适应。在这些肿瘤的空间背景下动态重组的来源仍然难以捉摸。在这里，通过空间分辨的转录组学、代谢组学和蛋白质组学来表征胶质母细胞瘤。通过破译患者之间区域共享的转录程序，推断胶质母细胞瘤是由谱系状态的空间分离组织的，并适应炎症和/或代谢刺激，让人联想到成熟星形胶质细胞的反应性转化。代谢成像和成像质谱流式细胞术的整合揭示了局部区域肿瘤宿主的相互依赖性，从而产生了空间专有的适应性转录程序。推断拷贝数改变强调与反应性转录程序相关的亚克隆的空间凝聚组织，证实环境压力会引起选择压力（环境选择）。植入人类和啮齿动物新皮质组织的胶质母细胞瘤干细胞模型模拟各种环境证实转录状态源于对各种环境的动态适应。
INTRODUCTION（空间多组学的必要性）
单细胞技术为健康人脑和恶性肿瘤中单个细胞的转录调控和动态进化提供了见解。高级别和低级别胶质瘤的scRNA-seq研究表明肿瘤内异质性和跨细胞状态的动态可塑性是恶性脑肿瘤的标志，包括间充质样（MES-like）、神经祖细胞样（NPC-like）、星形胶质细胞样（AC-like）和少突前体细胞样（OPC-like）状态。既往研究往往忽略了局部微环境在胶质瘤发生中的作用，单细胞分析仅能提供细胞间相互作用的推断，但空间组织信息是缺失的，因而空间转录组学的出现使得原位表征恶性脑肿瘤的细胞间和微环境间作用成为可能。除了转录组外，代谢因素对胶质瘤的动态适应产生决定性影响，例如缺氧导致的代谢恶化显著推动了基因组不稳定性，人们也越来越关注肿瘤细胞和免疫系统之间的相互作用，例如表观遗传免疫编辑驱动获得性免疫入侵程序，导致胶质母细胞瘤中出现空间异质性景观。因此，将空间水平上的多组学信息进行整合有助于破译胶质瘤转录调控和动态适应的原因。
RESULTS
Atlas of spatially resolved transcriptomics in glioblastoma
从28个胶质母细胞瘤（GBM）样本获取了88793个跨越不同年龄组和解剖区域的空间转录组图谱（stRNA-seq），并补充了空间代谢组学（基质辅助激光解析电离, MALDI）和蛋白组学（成像质谱流式，IMS）的分析数据（下图）。
图1. 工作流程及空间数据集所用分析方法示意图
为了解决空间转录组的精度问题，文章提到了两种方式：
-
（1）a machine-learning-based segmentation technique to predict the exact number of nuclei within each spot
识别每个spot的细胞数
-
(2) an artificial neural network (ANN) model trained to predict the number of tumor cells per spot, based on a simulated dataset consisting of randomized
cellular assemblies from paired st-/scRNA-seq datasets (n = 5)(也是我们常用的方法)
单细胞数据模拟多细胞spot
为了使结果与组织学分类的普遍黄金标准相结合，根据常春藤 GAP 组织学分类系统预测了逐spot组织学表型（这样的工作常人真的是难以完成）
Examples of the different resolutions of histologically defined regions
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与组织病理学特征相比，具有低肿瘤细胞频率的样本主要包含浸润区域，其中健康皮层内的肿瘤细胞难以描绘
Deciphering spatially resolved transcriptional heterogeneity
研究的目标是通过将它们与现有的转录和组织学分类联系起来来识别重复出现的转录空间模式（也因此取样的时候含有肿瘤细胞少的spot全部去除）。GBM transcriptional subgroups 的空间定位，如最初使用 bulk RNA-seq 描述并使用 scRNA-seq 进一步表征，仍不清楚。我们和其他研究者人为transcriptional subgroups在空间上是分离的，并在肿瘤内行使不同的功能。为了解决空间上的转录异质性，首先必须解决的就是空间表达模式，再将这些结果汇总到整个队列中。为了实现这一目标，依次消除了混杂因素，包括患者间变异性、技术伪影和测序深度的变异性。随后整合了患者空间加权相关矩阵（逐个聚类），然后是层次聚类，确认了五个重复的空间不同转录程序的空间分离。这种方法使作者能够了解在整个队列中稳健表达的患者特异性簇中转录程序的生物学意义。其中，在90%的样本中都包含5个一致表达的转录程序，分别为与缺氧反应和糖酵解基因相关、以少突胶质细胞特征为标志、富集放射状神经胶质细胞或炎症相关基因，以及以神经发育为特征的类群。
探索空间表达模式
识别空间转录转录程序主要分为以下三个步骤：
- identification of patientwise robust regional transcriptional programs
- horizontal integration across patients using shared transcriptional programs as anchors and spatially weighted correlation to explore colocalization of transcriptional programs
- characterization of the spatial organization of shared programs
Heatmap of spatially resolved transcriptomics of glioblastoma
Heatmap of the spatial-weighted correlation analysis of the 99 individual transcriptional programs. Hierarchical clustering (Ward.D2) confirmed 5 programs(Calinski method, right) with large spatial congruence. The percentage of programs per patient contributing to each cluster is shown to the left
Spatially weighted correlation analysis of the enrichment scores and spatial overlap of current transcriptional signatures. By clustering all signatures, three
major branches appear: glia-like, neuronal-like, and stress-response reactive signatures. Signatures with high cross correlation are marked by lines
空间上不同的转录状态独立于细胞周期状态，并且与现有的分类系统一致
空间上不同的转录程序和亚克隆结构
拷贝数改变（CNAs），包括癌基因的局部扩增或肿瘤抑制因子的丢失，是恶性细胞的标志，而CNAs与特定细胞状态相关联，在缺氧反应类别中，确定了作为独立亚克隆事件发生的CNAs的显著积累。利用推断的 CNA 研究了基因组改变和空间上不同的转录程序之间的关系
the workflow for copy number analysis
Validation of CNA Analysis
Heatmap of different CNAs across spatially distinct transcriptional subtypes. In the bar plot at the bottom, we quantified the relative numbers of exclusive
subclones that occur only in the defined spatially distinct subgroups. Violin plots represent the relative numbers of unique CNA events (subclones) across spatially distinct transcriptional programs. Significance was determined using Mann-Whitney U test, and p values were corrected for multiple testing using the Bonferroni method
作者进一步研究空间上不同的转录多样性是否可以直接反映肿瘤内的遗传亚克隆。作者通过 CNA 的患者特异性层次聚类重建了克隆体系结构。鉴定了 57 个遗传亚克隆，每个样本跨越 2 到 6 个亚克隆。然后，作者确定了每个亚克隆中个体、空间上不同的转录程序的分布。分析表明，在 26.32% 的所有亚克隆中，单一转录程序占主导地位。这些发现得出结论，尽管亚克隆偶尔偏向于空间 OPC (8.77%) 或反应性缺氧程序 (10.52%)，但克隆结构对空间不同转录程序的发生影响有限。
Transcriptional subgroups are independent of the subclonal architecture
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GBM中与反应性缺氧程序相关的代谢改变（关于空间代谢组学，我目前仍然是一片空白）
为了进一步探索空间上不同的反应性缺氧模式，作者使用空间代谢组学技术从连续用于 stRNA-seq 的组织切片（患者，n = 6) 。实施了一个类似于 stRNA-seq代谢谱的工作流程，降维揭示了前两个主要成分中的主要差异，从而确定了三个显著的代谢亚组后校正集群稳定性。功能代谢分析显示在第一代谢模块（M-G1）磷酸戊糖途径显著富集。第二个代谢亚组（M-G2）的特征是磷酸腺苷酸代谢富集。最终的代谢亚组（M-G3）在糖酵解和氨基糖代谢方面高度富集。
针对空间上不同的转录程序反应性缺氧，在作者的综合分析（WNN 聚类）中作为一个独特的簇出现。组织学上，分配给反应性缺氧程序的大多数斑点代表坏死边缘。作者假设低氧代谢导致基因组不稳定性在空间隔离的生态位中积累。这些“反应岛”代表了从头的潜在来源基因组改变有助于肿瘤细胞产生治疗抗性。
进一步探索富含反应性缺氧特征的区域。区域被定义为缺氧核心，并富集糖酵解途径。还显示出多条染色体（8p、9p、13q、19q 和 21q）的独特损失和增加，这种变异最有可能由缺氧核心区域内的单个亚克隆解释，这证明了缺氧相关代谢是一种潜在的假设基因组不稳定性的驱动因素。
Integration of spatially resolved metabolomic and transcriptional data
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反应性缺氧区域积累染色体改变
作者分析了来自 TCGA 数据库的样本（患者 GBM IDH1/2野生型 n = 357），根据患者的缺氧基因表达评分对患者进行分类。缺氧驱动的肿瘤显示染色体改变显著增加，证实了代谢和基因组不稳定性之间的关系。结果主要表明，低氧/氧化应激增强了基因组的不稳定性，有助于在亚克隆选择的支持下加强 GBM 的微进化以恢复弹性。为了通过实验验证作者的假设，作者在常氧和缺氧条件下培养原发性患者来源的GBM 细胞系2-6 周（患者 n = 4）。拷贝数变异揭示了 CNA 谱的差异，在慢性缺氧条件下 CNA 事件的显著积累证实了压力诱导的 CNA 改变的假设。
作者通过分析常氧和缺氧条件下CpG 位点cg12434587 和 cg12981137处的 O-6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶 (MGMT) 启动子甲基化来探索缺氧代谢对DNA 甲基化的影响。细胞系当暴露于缺氧时，在常氧下具有未甲基化的 MGMT 启动子会产生高甲基化。这些发现进一步加强了关于代谢驱动的 CNA 的假设，其中大多数从头重排必须被视为随机事件，有助于肿瘤的亚克隆进化。
TCGA and cell-culture validation of hypoxia-associated CNA alterations
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低氧代谢调节GBM中的“去或成长”潜力
在对空间分辨转录程序的初步表征中，反应性缺氧程序在非循环细胞中显著富集。表明缺氧应激会触发细胞周期停滞，特别是 S 期停滞。导致假设缺氧驱动的 S 期停滞有助于基因组不稳定性的积累。
GBM 细胞的基线转录状态可以分配给“发育”（AC-、OPC-或 NPC 样）程序。在空间上，代谢谱显示磷酸戊糖途径 (PPP) 的富集。由于增殖和肿瘤生长，会发生越来越多的营养和氧气缺乏，迫使采用代谢程序进行糖酵解。这种现象是 PPP 和糖酵解之间的相互转换，与肿瘤细胞的生长或生长潜力有关，表明 PPP 支配着由生长的肿瘤细胞组成的区域。
当缺氧发生时，这种低氧诱导的糖酵解转换随后的诱导，这有助于细胞逃逸/迁移到含氧量正常的区域。由于在缺氧条件下发生的细胞周期程序的下调，会发生 S 期停滞，导致随后从头CNA 的积累。作者假设这些受缺氧影响的细胞中有很大一部分随后进入凋亡状态，导致在 GBM 中看到的特征性坏死。只有一小部分细胞通过迁移相关转录程序的上调成功逃脱。除缺氧外，据报道，其他压力源（如放射或化疗）会导致 GBM 出现这种与压力相关的扰动。
根据这个模型，可以看到低氧代谢和细胞迁移之间的反比关系。为了探索代谢改变区域中迁移基因表达特征的富集，作者确定了特定基因表达特征的低富集和高富集之间的定向梯度的空间方向。每个点的方向向量是基于其局部邻域中所研究的基因表达特征的分级富集。这些向量场计算使作者能够近似空间基因表达轨迹，从而能够识别空间上相反的转录途径。基于这些矢量场计算，作者报告缺氧响应和迁移特征显示反向空间轨迹。总之，作者的研究结果为代谢变化和氧化应激是基因组多样性的潜在互惠驱动因素提供了证据，从而导致 GBM 中的克隆进化。
Illustration of the hypoxia-stress concept and escape mechanism
探索反应性免疫区域的肿瘤-宿主相互依赖性
通过选择反应性免疫和反应性缺氧计划区域内的 ROI，并从分类为神经元分化的区域中控制 ROI。得到分割后 82,179 个细胞的综合蛋白质组图（空间白蛋白组学）。
作者的分析显示骨髓细胞和淋巴样细胞在归类为反应性免疫的区域中。为了研究免疫富集区域的肿瘤细胞分化，作者通过将细胞细分为放射状胶质细胞（EGFR + HOPX +）、反应性免疫（EGFR + CHI3L1 + VIM +）、空间 OPC（EGFR + OLIG1 + )、神经发育(EGFR + SNAP25 + CALM2 + ) 和反应性缺氧 (EGFR + VEGFA + )。反应性免疫（EGFR）的独家富集+ CHI3L1 + VIM + ) 细胞仅在转录定义的反应性免疫定位中得到证实。
为了补充关于免疫系统和 GBM 之间细胞关系的发现，作者根据肿瘤细胞与淋巴或骨髓细胞之间的距离量化了它们之间的细胞连接性 ，证实了肿瘤细胞与转录定义的反应性免疫区域中的免疫区室之间的细胞相互作用增强。接下来，作者探索了不同 ROI 中细胞类型的分布。作者证实了在反应性免疫和缺氧中疑似富集 AC 和 MES 样细胞。OPC 样细胞主要富集于神经发育ROI。此外，反应性免疫和缺氧区域均显示肿瘤相关骨髓细胞 (TAM) 和 T 细胞的显著富集。
鉴于 T 细胞在两个反应区域都富集，作者研究了 T 细胞上的平均PD-1 蛋白水平 (CD3+ )，与反应性缺氧和神经发育相比，反应性免疫区域内显著增加，表明反应性免疫 ROI 中的局部免疫抑制增强。此外，代表 GBM 免疫景观的 scRNA-seq 数据集证实了肿瘤反应性免疫区域中记忆和耗尽的 T 细胞的富集
Integration of single-cell mass cytometry
环境条件有助于双向亚型转变
虽然已有大量研究表明炎症环境驱动转路适应从而导致GBM异质性，但是尚不清楚这种转变是否可逆，如果将微环境引起转录重编程的肿瘤细胞重新暴露于健康大脑会发生多大程度的变化呢。于是研究人员将MES样原发性患者衍生细胞接种到培养4天的来自不同年龄的多个人类和大鼠供体的皮层组织切片中，通过scRNA-seq进行转录分析。在中青年人类供体中，OPC-、AC-和NPC样细胞显著增多，而老年供体中MES样/反应性细胞类型显著增多，在啮齿类工体环境中培养的GBM细胞表现出MES和AC样转录特征的富集，说明宿主环境在重塑转录程序方面发挥重要作用。
Ex vivo human cortical culture indicates the bidirectional shift through environmental impact
讨论
在过去几年中，通过单细胞分析技术进步取得的众多发现彻底改变了对肿瘤异质性和可塑性以及潜在治疗选择的理解。然而，尚未研究脑肿瘤空间组织的重要性。在这里，作者揭示了微环境与GBM转录异质性的时空变化之间的双向和单向相互作用的见解。揭示了五个空间上不同的转录程序的存在，这些转录程序以共享的转录特征和专有的基因组改变为标志。尽管在 GBM 中有 CNA 的先前描述，但以前没有报道过区域模式和与转录程序的关联。并对对细胞状态、组织学模式和空间专有转录程序进行整体比较。
这种以空间分辨方式在各种分子水平上全面表征 GBM 有助于发现细胞状态的动态适应及其在肿瘤微环境中的空间关系。作者数据表明，在 S 期停止后，严重缺氧等代谢改变会导致增殖受损，从而导致 CNA 的显著积累。这种现象已在其他癌症类型中报道，并且存在足够的证据详细说明缺氧条件下基因组不稳定性的增加。作者在 2D 细胞培养和 TCGA 数据中的结果和验证表明，区域缺氧代谢代表了基因组不稳定性的潜在储存库，并代表了微进化的驱动因素，从而使耐药表型的进化成为可能。
Method
我们主要来关注一下空间的CNV估计
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关于SPATA，大家可以参考文章SPATA
CNV分数矩阵的聚类，inferCNV选择subcluster模式会进行层次聚类。
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