2022-09-26

Cancer Discov | 胶质母细胞瘤中肿瘤与免疫环境的自然协同进化

原创 huacishu 图灵基因 2022-09-26 10:10 发表于江苏

收录于合集#前沿生物大数据分析

撰文：huacishu

IF=87.241

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

1、作者对来自八个多病灶IDH野生型原发性GBM的61062个单细胞进行了测序，并确定了肿瘤的自然进化特征（NES）。作者发现，NES与调节大脑发育的转录因子（包括MYBL2和FOSL2）的激活显著相关；

2、作者证实缺氧可能通过激活HIF1A-FOSL2轴诱导NES转变。高NES肿瘤细胞可以通过激活FOSL2-ANXA1-FPR1/3轴来招募和极化骨髓源性巨噬细胞；

3、作者的研究提供了一个前所未有的高分辨率自然肿瘤演变特征，随后是免疫环境重塑和肿瘤迁移。肿瘤细胞和巨噬细胞之间的频繁相互作用可能会增强我们对GBM进展的理解。

南京医科大学汪强虎教授课题组在国际知名期刊Cancer Discov在线发表题为“Natural coevolution of tumor and immunoenvironment in glioblastoma”的论文。IDH野生型胶质母细胞瘤（GBM）预后不佳。更好地理解肿瘤的演变是开发更有效治疗方法的关键。作者通过使用罕见的多病灶样本来研究胶质母细胞瘤的自然进化轨迹。

对来自八个多病灶IDH野生型原发性GBM的61062个单细胞进行了测序，并确定了肿瘤的自然进化特征（NES）。作者发现，NES与调节大脑发育的转录因子（包括MYBL2和FOSL2）的激活显著相关。缺氧可能通过激活HIF1A-FOSL2轴诱导NES转变。高NES肿瘤细胞可以通过激活FOSL2-ANXA1-FPR1/3轴来招募和极化骨髓源性巨噬细胞。这些极化巨噬细胞能有效抑制T细胞活性并加速肿瘤细胞的NES转化。此外，极化巨噬细胞可以上调CCL2以诱导肿瘤细胞迁移。

IDH野生型胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见和最具侵袭性的脑肿瘤。由于肿瘤中恶性肿瘤的演变，改善GBM预后仍然具有挑战性。目前，免疫检查点抑制剂（ICIs）可改善许多癌症的预后，但它们尚未为GBM患者带来实质性临床益处，可能是由于GBM中存在显著的免疫抑制肿瘤环境。

肿瘤细胞和免疫细胞之间的通讯在肿瘤进展中起着关键作用。尤其是，浸润性巨噬细胞通过各种细胞因子和趋化因子的释放促进肿瘤血管生成、生长和耐药性。因此，系统地描述GBM的自然进展并揭示疾病进展过程中免疫微环境重塑的潜在机制至关重要。

目前，已经构建了几个模型来探讨GBM的进展。尽管这些研究大大提高了我们对肿瘤演变和治疗失败的理解，但它们主要关注治疗后的基因组变化。由于缺乏合适的模型和技术，肿瘤细胞在自然疾病进展过程中如何与肿瘤微环境相互作用尚不清楚。作者通过将单细胞RNA测序（scRNA-seq）应用于多病灶IDH野生型原发性GBM来研究肿瘤进展，从而对肿瘤自然进化过程进行前所未有的高分辨率表征。

基于scRNA-seq数据的多病灶GBM景观

作者整合了306324个单细胞，涉及转录组、表观基因组和蛋白质组数据，以研究原代GBM自然进化下肿瘤细胞与微环境之间的关系（图1A）。首先招募了四名诊断为多病灶性GBM的患者，其中的标本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。通过在scRNA序列图谱上使用K-means聚类算法，将每个病灶中的细胞分为不同的簇，然后进行肿瘤细胞推断（图1B）。

接下来，根据单细胞mRNA表达谱推断每个肿瘤细胞的染色体拷贝数来探索这些病例的基因组特征。由此得到的拷贝数分布图显示，四个病例中的每一个都有两个病灶来自同一祖先，反映出在GBM中常见的共享拷贝数改变。

为了进一步证实每个病例两个病灶之间的潜在进化序列顺序，对来自同一患者的两个病灶的肿瘤细胞进行了RNA速度分析（图1C）。作者发现这四个肿瘤都有从第二病变向第一病变转变的潜在趋势。因此，这些结果表明，第二病变中的肿瘤细胞可能充当新的“竹笋”，最终可能发展为第一病变中肿瘤细胞的表型。

进一步根据scRNA序列数据对非肿瘤细胞进行聚类。使用细胞特异性标记物，包括FCGR1A（髓样）、COL1A1（成纤维细胞样）、CD3D（T细胞样），CDH5（内皮样）和MAG（少突胶质细胞样）等，确认每个簇的细胞类型（图1D，E）。在GBM中，肿瘤相关巨噬细胞可能来源于外周骨髓源性巨噬细胞（BMDM）或常驻小胶质细胞（MG）。作者在四个病例的scRNA序列数据中识别出BMDM和MG细胞。第一个病灶的BMDMs与MGs的比率高于第二个病灶（图1F）。

自然进化特征与GBM预后不良相关

由于已经确认了四个病例（即NJ01、NJ02、TT01和TT02）中两个病变之间的假定进化顺序，接着思考什么样的转录特征可以表征这种进化。为了解决这个问题，作者首先关注NJ01和NJ02，以确定第一和第二病变中肿瘤细胞之间的差异表达基因（DEG）（图2A）。发现第一个病灶中DEGs的表达百分比明显高于第二个病灶，这表明GBM的自然进化可能伴随着广泛的基因激活。

如图2B所示，与年轻病变相比，老年病变中表达NES基因的肿瘤细胞比例更高。在TCGA-GBM数据集中，所有NES基因在肿瘤中的表达水平均高于非肿瘤样本。接下来，使用单样本基因集富集分析（ssGSEA）算法构建了一个基于NES基因的评分算法。轨迹分析表明，具有高NES（hNES）的肿瘤细胞在轨迹分支点附近富集，表明hNES可能是GBM进化终点。功能富集分析表明，这些特征基因与凋亡、血管生成和缺氧等途径相关（图2C）。

接下来，应用NES算法分析了来自患者外植体（PDE）的数据集。作者发现，第三代样本中NES高肿瘤细胞的比例很高（图2D）。此外，作者研究了RCAS-TVA胶质瘤小鼠模型的数据集，发现辐射7周后收集的样本中NES高肿瘤细胞的百分比比辐射2周或5周后的样本高4倍以上（图2E）。最后，从一名诊断为原发性和复发性GBM的患者身上采集了两份标本发现，12个NES基因中有10个（83.3%）在复发样本中表达较高。

GBM主要由四种细胞状态组成，包括神经祖细胞样（NPC）、少突胶质祖细胞样细胞（OPC）、星形胶质细胞样（AC）和间充质样（MES）细胞，细胞状态具有可塑性。因此，作者探索了NJ01第1和第2个病变中scRNA序列水平上细胞状态之间的NES变化。作者观察到沿着NPC/OPC-AC-MES轴有明确的细胞状态转变，NES呈比例逐步增加（图2F）。其中，NES显示了从PN到MES亚型的逐步增加和过渡方向（图2G）。

接下来，探讨了NES与GBM IDH野生型患者临床结局之间的关系。将TCGA中肿瘤纯度>0.2的样本分为低NES（lNES）和高NES（hNES）组，并比较它们的总生存率。lNES组的总生存期比hNES组长（图2H）。利用中国胶质瘤基因组图谱（CGGA）的数据进一步验证了这一结果（图2H）。控制年龄的多变量分析表明，NES是一个独立的预后因素。

缺氧可能通过HI1FA-FOSL2轴参与NES过渡

接下来研究了NES转化过程中潜在的转录调控。作者发现四种TF的调节活性得分与NES增加显著正相关，包括CEBPB、FOSL2、SPI1和ZBTB7A（图3A）。据报道，NES基因CEBPB和FOSL2是促进肿瘤进展的关键调节因子。在NES较低的样品中，MYBL2、FOXM1、NRF和E2F1 TF被显著激活（图3A）。在这些TF中，E2F1和MYBL2都参与细胞增殖和生长的调节。这些TF在大脑发育中也显示出不同的表达模式（图3B），其中hNES相关TF更可能在发育后期表达，这与其他组织类型发育中的观察结果不同。

为了确定促进NES状态转变的潜在因素，作者首先测试了NES与一系列微环境相关通路之间的相关性，包括缺氧反应、免疫反应和PH降低（图3C）。缺氧反应与NES显著相关。通过比较不同氧气水平培养的胶质瘤细胞之间的NES变化，发现缺氧条件下肿瘤细胞的NES较高（图3D）。

在缺氧条件下，通过敲低肿瘤细胞上的缺氧诱导因子（例如HIF1），NES显著降低（图3E），表明缺氧在加速NES转变中起着重要作用。此外，用siHIF1治疗的肿瘤细胞显著降低了FOSL2 mRNA水平（图3F）。总之，这些发现表明缺氧可能通过HI1FA-FOSL2轴潜在地参与NES转换。

hNES肿瘤细胞与骨髓源性巨噬细胞浸润相关

单细胞分析显示，BMDM在较老（第1个）病变中富集。为了证实这一发现，使用ssGSEA将NES与TCGA IDH野生型GBM中的BMDM和MG相关联。发现BMDM特征与NES呈正相关（图4A）。基于两次GBM活检（NJ03和NJ04）的CyTOF分析也表明，hNES样GBM的BMDM数量与MG数量的比率较高（图4B）。

为了进一步研究BMDM/MG和NES之间的潜在关系，作者分析了MRI定位活检的GBM mRNA表达谱。BMDM和NES在对比增强区均显示较高的富集分数（图4C），表明BMDM和hNES肿瘤细胞易于在肿瘤组织的核心区富集。

从GBM的不同区域采集活检组织，包括细胞肿瘤区域（CT）、浸润性肿瘤区域（IT）、前沿区域（LE）、微血管增殖区域（MP）和假栅栏细胞区域（PC）。作者发现hNES样本在PC区域显著富集（图4D）。BMDM和MG主要分别富集于MP和LE区域（图4D）。原位杂交图像观察到FOSL2和CD163在PC区共定位（图4E）。综上所述，这些发现表明BMDM浸润可能与hNES肿瘤细胞有关。

基于NJ01第二病变的scRNA序列数据探索细胞间通信，作者发现“肿瘤细胞-髓样T细胞”通信轴是细胞通信网络的重要组成部分（图4F）。总的来说，较老（第1个）病变比较年轻（第2个）病变显示更多的配体-受体相互作用（图4G）。最后，通过探索TCGA IDH野生型GBM的mRNA表达，发现ANXA1表达与BMDM特征分数显著相关（图4I），但与MG特征分数无关，表明ANXA1可能与BMDM浸润相关。

ANXA1与骨髓源巨噬细胞的招募和极化相关，以诱导免疫抑制

接下来，使用ChIP地图集搜索ANXA1的潜在调控机制。作者发现，转录因子FOSL2在ANXA1启动子的上游区域三个神经祖细胞中显示出一个尖峰（图5A）。在TCGA IDH野生型GBM中，ANXA1表达与FOSL2表达呈正相关（图5B）。

为了确认来自肿瘤细胞的ANXA1对单核细胞的影响，基于单核细胞和U251MG GBM细胞系进行了Transwell迁移分析。对照组的单核细胞更有可能向肿瘤细胞迁移（图5C）。72小时后，与siANXA1组相比，对照组的单核细胞显示出M2样巨噬细胞的特征（图5D），表明ANXA1诱导单核细胞分化为免疫抑制状态。值得注意的是，对照组的IFNγ水平和T细胞增殖率明显低于其他组（siANXA1组）（图5E）。

由于ANXA1可以重塑肿瘤组织的免疫环境，接下来考察的是ANXA1是否可以帮助肿瘤细胞利用生存优势。通过比较大脑内注射GL261小鼠GBM细胞系的小鼠与对照组Anxa1敲除的小鼠（图5G，H），作者发现对照组小鼠的肿瘤大小明显大于其他组（图5I）。与此观察结果一致，shAnxa1组小鼠的中位生存时间明显长于对照组（图5K）。综上所述，ANXA1在抑制免疫活性和促进肿瘤进展方面发挥了重要作用，这可能是GBM治疗的潜在靶点。

BMDM浸润加速肿瘤NES转化和迁移

通过分析原发性和复发性GBM的mRNA谱，作者发现复发性和匹配性原发性GBM之间BMDM标准化特征分数的差异与手术间隔时间的增加显著相关（图6A）。共培养的肿瘤细胞显示出比单核培养条件下更高的NES评分（图6B），表明BMDM细胞有助于加速NES转变。此外，通过富集分析表明，上皮-间充质转化（EMT）途径与NES显著相关，并在共培养条件下高度上调（图6C）。

FOSL2是促进EMT的重要转录因子。FOSL2的mRNA在与巨噬细胞共同培养的肿瘤细胞中显示出较高的表达水平（图6D）。肿瘤转移主要涉及TWIST、ZEB2、COX2和VEGFs等基因集。使用ssGSEA算法，发现共同培养条件下的肿瘤细胞显示出这些基因的高富集度（图6E）。此外，与对照组相比，具有高迁移能力的弥漫性胶质瘤细胞显示出更高的NES评分（图6F）。

作者进一步研究了BMDM是否与GBM相互作用并促进肿瘤迁移。基于TCGA IDH野生型数据集的分析表明，转移样特征与BMDM和单核细胞特征分数显著相关（图6G）。肿瘤相关巨噬细胞可能通过分泌细胞因子（包括CCL2、CCL20等）促进肿瘤转移和进展。CCL2和CCL20与NES得分高度相关（图6H）。当比较四对多病灶性GBM中表达这两个基因的巨噬细胞的百分比时，作者发现CCL2易于在巨噬细胞中广泛表达（图6I）。

此外，进一步分析表明，CCL2主要在巨噬细胞中表达（图6J）。肿瘤浸润巨噬细胞中CCL2 mRNA水平高于外围单核细胞（图6K），这表明CCL2的上调只是肿瘤浸润巨噬细胞的表型。受这些发现的启发，在shCCL2或shNC（对照）条件下进行了48小时的Transwell迁移分析（图6L）。对照组中的肿瘤细胞更有可能向Transwell装置的下室迁移（图6M），这证实了CCL2可以促进肿瘤细胞迁移。

结论

多病灶肿瘤，尤其是那些起源于单一祖先的病灶，是研究自然肿瘤演化的极好模型，因为不同病灶之间的初始基因改变得到了很好的控制。作者通过对四对GBM的深入分析来表征GBM的演变。作者定义了一个NES来概括未经治疗的肿瘤演变过程中的分子变化。NES的有效性通过其与肿瘤发展、临床结果和肿瘤细胞状态的显著相关性得到证实。这些发现共同揭示了NES表征了GBM自然进化历史的分子变化。

肿瘤的演变被认为与许多涉及缺氧等因素有关。作者的研究表明缺氧可通过激活HIF1A-FOSL2轴潜在地促进NES转换（图7）。FOSL2调节ANXA1，ANXA1随后可能招募并诱导单核细胞极化为M2样巨噬细胞（图7）。这些极化的BMDM表现出免疫抑制表型，显著降低CD8+T细胞的增殖和IFNγ的产生，对GBM免疫治疗的发展提出了挑战。总之，“HIF1A-FOSL2-ANXA1”调控轴为我们理解自然肿瘤演变及其与免疫微环境重塑的关系提供了一个新的视角。

研究结果还表明，与极化巨噬细胞共同培养的肿瘤细胞倾向于增加NES，这可能与多种转录因子（如FOSL2）和通路（如EMT）的激活有关。这种进展还伴随着迁移能力的增强，这与极化巨噬细胞产生的CCL2有关（图7）。由于CCL2主要表达于浸润肿瘤组织的巨噬细胞，以CCL2为靶点可能是减缓肿瘤进展的潜在疗法。

目前的研究尚未完全确定NES转变与微环境重塑之间的因果关系。这受到精确捕获GBM发展的完整阶段的技术挑战的限制。因此，需要进行更多的研究来探索肿瘤细胞与肿瘤演化过程中微环境之间的关系。此外，本研究仅关注配体对靶细胞（如ANXA1）的影响，而非细胞受体（如FPR1/3）。这主要是因为与这些受体相比，这些配体在肿瘤中的表达水平异常，可能更适合靶向治疗。

总之，作者的研究提供了一个前所未有的高分辨率自然肿瘤演变特征，随后是免疫环境重塑和肿瘤迁移。肿瘤细胞和巨噬细胞之间的频繁相互作用可能会增强我们对GBM进展的理解。

教授介绍

汪强虎教授是美国德州大学安德森癌症中心博士后，南京医科大学教授、博士研究生导师、东南大学博士生导师（兼）、生物信息学系主任、生物信息学专业负责人、江苏省转化医学研究院医学大数据解读平台负责人。长期从事生物信息学和肿瘤基因组学研究，在肿瘤分子异质性、微环境解构、肿瘤干细胞可塑性等方向具有研究优势。主持包括3项国家自然科学基金项目在内的省部级以上科研课题8项，江苏省"杰出青年"基金获得者、江苏省"六大人才高峰"高层次人才培养对象、南京医科大学"高层次青年科技人才"。

曾获中国医师协会脑胶质瘤专业委员会优秀论文一等奖、安德森癌症研究中心Caroline Ross冠名杰出研究奖。发表SCI收录论文40余篇，累计SCI影响因子为385分，论文累计被引超2000次，H-index达20，其中14篇论文被引超过50次，高被引文章（Highly Cited Paper）2篇。近年来，以第1、并1或通讯作者 Cell、Cancer Cell、NAR等权威杂志发表SCI论文14篇。美国神经肿瘤学会会员、美国癌症研究协会会员、中国系统工程学会医药分会理事、江苏省生物信息学专业委员会委员、江苏省抗癌协会委员。

参考文献

Wu L, Wu W, Zhang J, et al. Natural coevolution of tumor and immunoenvironment in glioblastoma. Cancer Discov. 2022;CD-22-0196. doi:10.1158/2159-8290.CD-22-0196