需要准备的试剂:TRIzol(主要成分是苯酚)、氯仿(酚:氯仿:异戊醇=25:24:1)、异丙醇、80%酒精(用RNase-free ddH2O配制)、RNase-free ddH2O。
实验流程
一、样品预处理(Sample Pretreatment)
①1毫升全血+1毫升RNase-free ddH2O。
②RNA血液保存液12000rpm离心5min,弃上清后加1毫升RNase-free ddH2O。
③200微升全血+1毫升RNase-free dd H2O。
④500微升全血+1500微升TRIzol(样品体积的3倍),彻底混匀。
所有样品在15-30℃放置5min。①②③样品在4℃下,12000rpm离心10min。
二、匀浆处理(Homogenization)
①②③弃上清后加入1毫升TRIzol,混匀。将①②③④样品在室温下放置5min。在4℃下,12000rpm离心10min。取上清至新的2毫升离心管中,加入2倍体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),剧烈震荡15s,室温放置3min,使其自然分相。
注:加入TRIzol后,如不需后续实验,可将样品放至-70℃长期保存。
三、RNA沉淀(RNA Precipitation)
1.在4℃下,12000rpm离心10min。
注:样品会分三层:黄色的有机相,中间层和无色的水相。RNA主要在水相中,把水相转移至新管中。不要吸取中间界面,否则将导致RNA样品中有DNA污染。
2.吸取上清至新的离心管中,加入等体积的冰异丙醇,室温放置20-30min。在4℃下,12000rpm离心10min。RNA沉淀于管底。
四、RNA漂洗(RNA Wash)
1.弃液体,加入与TRIzol相同体积的80%酒精(用RNase-free ddH2O配制),缓慢的上下颠倒,悬浮沉淀,
2.在4℃下,12000rpm离心3min。弃液体,室温放置30min(液体蒸发完即可,不宜放置太久,RNA样品过于干燥会很难溶解)。
五、溶解RNA(Redissolving the RNA)
沉淀中加入30-100微升RNase-free ddH2O,用枪头吹打混匀。-70℃长期保存。
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