莎莎写于2020.5.2
这是5月坚持的第2天，要一直坚持写啊，加油!
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差异基因的功能注释和富集分析:
• GO和KEGG富集分析
• 基因集富集分析
MsigDB数据库
GSEA分析
GSVA分析
1.GO数据库官网：http://geneontology.org/
GO(gene ontology)是基因本体联合会(Gene OnotologyConsortium)所建立的数据库，旨在建立一个适用于各种物种的，堆积因和蛋白质功能进行限定和描述的，并能随着研究不断深入而更新的语言词汇标准。它是多种生物本体语言中的一种，提供了三层结构的系统定义方式，用于描述基因产物的功能。
- 基因本体将涉及的基因和基因产物词汇分为三大类，发展了具有三级结构的标准
语言（ontologies），涵盖生物学的三个方面：
•细胞组分（cellular component，CC）：细胞的每个部分和细胞外环境，亚细
胞结构、位置和大分子复合物，如核仁、端粒和识别起始的复合物等；
•分子功能 （ molecular function ， MF ）： 可 以 描 述 为 分 子 水 平 的 活 性
（activity），如催化（catalytic）或结合（binding）活性；
•生物过程（biological process，BP）：生物学过程系指由一个或多个分子功能
有序组合而产生的系列事件。其定义有广义和狭义之分，在词义上可以区分
为泛指和特指。一般规律是，一个过程是由多个不同的步骤组成，分子功能
的有序组合，达成更广的生物功能，如有丝分裂或嘌呤代谢等。
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2.KEGG数据库官网： http://www.genome.jp/kegg/
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(1)KEGG
rm(list = ls())
options(stringsAsFactors = F)
library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
# 读取3个软件的差异分析结果
load(file = "data/Step03-limma_voom_nrDEG.Rdata")
limma_DEG <- nrDEG
load(file = "data/Step03-DESeq2_nrDEG.Rdata")
DESeq2_DEG <- nrDEG
load(file = "data/Step03-edgeR_nrDEG.Rdata")
edgeR_DEG <- nrDEG
# 根据需要更改DEG的值
DEG <- limma_DEG
#### KEGG analysis
#### 第一步，确定上下调基因
# 获得差异倍数阈值
logFC_cutoff <- with(DEG, mean( abs(log2FoldChange) ) + 2 * sd(abs(log2FoldChange)))
logFC_cutoff <- round(logFC_cutoff,2)
DEG$change = as.factor( ifelse( DEG$pvalue < 0.05 & abs(DEG$log2FoldChange) > logFC_cutoff,
ifelse( DEG$log2FoldChange > logFC_cutoff , 'UP', 'DOWN' ), 'STABLE' ) )
table(DEG$change)
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#### 第二步，从org.Hs.eg.db提取ENSG的ID 和GI号对应关系
keytypes(org.Hs.eg.db)
# 如果ENSG的ID具有小数点，用下面两句代码舍掉小数点
# library(stringr)
# rownames(DEG) <- str_sub(rownames(DEG), start = 1, end = 15)
DEG$ENSEMBL <- rownames(DEG)
# bitr in clusterProfiler
df <- bitr( rownames(DEG), fromType = "ENSEMBL", toType = c( "ENTREZID" ), OrgDb = org.Hs.eg.db )
head(df)
# 22.7% of input gene IDs are fail to map...
ID转换
#### 第三步，将GI号合并到DEG数据框内
f <- 'data/Step05-DEG_ENTREZID_for_GSEA_GSVA.Rda'
if(!file.exists(f)){
DEG$SYMBOL <- rownames(DEG)
DEG <- merge(DEG, df, by='ENSEMBL') #合并
head(DEG)
dim(DEG)
# DEG数据会减少！
save(DEG, file = "data/Step05-DEG_ENTREZID_for_GSEA_GSVA.Rda")
}
load("data/Step05-DEG_ENTREZID_for_GSEA_GSVA.Rda")
这一列被加到了数据框中
#### 第四步，提取上调和下调的GI集
gene_up <- DEG[ DEG$change == 'UP', 'ENTREZID' ]
gene_down <- DEG[ DEG$change == 'DOWN', 'ENTREZID' ]
gene_diff <- c( gene_up, gene_down )
gene_all <- as.character(DEG[ ,'ENTREZID'] )
geneList <- DEG$log2FoldChange
names( geneList ) <- DEG$ENTREZID
geneList <- sort( geneList, decreasing = T ) #从大到小排序
## KEGG pathway analysis
f <- 'data/Step05-enrichKEGG.Rdata'
if(!file.exists(f)){
kk.up <- enrichKEGG( gene = gene_up ,
organism = 'hsa' ,
universe = gene_all ,
pvalueCutoff = 0.8 ,
qvalueCutoff = 0.8 )
kk.down <- enrichKEGG(gene = gene_down ,
organism = 'hsa' ,
universe = gene_all ,
pvalueCutoff = 0.05 )
save(kk.up,kk.down,file = "data/Step05-enrichKEGG.Rdata")
}
load(file = "data/Step05-enrichKEGG.Rdata")
head(kk.up)[ ,1:6 ]
head(kk.down)[ ,1:6 ]
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library(ggplot2)
kegg_down_dt <- as.data.frame( kk.down )
kegg_up_dt <- as.data.frame( kk.up )
down_kegg <- kegg_down_dt[ kegg_down_dt$pvalue < 0.05, ]
down_kegg$group = -1
up_kegg <- kegg_up_dt[ kegg_up_dt$pvalue < 0.05, ]
up_kegg$group = 1
dat = rbind( up_kegg, down_kegg )
dat$pvalue = -log10( dat$pvalue )
dat$pvalue = dat$pvalue * dat$group
dat = dat[ order( dat$pvalue, decreasing = F ), ]
g_kegg <- ggplot( dat, aes(x = reorder( Description, order( pvalue, decreasing=F ) ), y = pvalue, fill = group)) +
geom_bar( stat = "identity" ) +
scale_fill_gradient( low = "blue", high = "red", guide = FALSE ) +
scale_x_discrete( name = "Pathway names" ) +
scale_y_continuous( name = "log10P-value" ) +
coord_flip() + theme_bw() + theme( plot.title = element_text( hjust = 0.5 ) ) +
ggtitle( "Pathway Enrichment" )
print( g_kegg )
ggsave( g_kegg, filename = 'figures/Step05-kegg_up_down_anno.png' )
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(2)GO
#### GO analysis
# 做GO数据集超几何分布检验分析，
# 重点在结果的可视化及生物学意义的理解。
g_list=list(gene_up=gene_up,
gene_down=gene_down,
gene_diff=gene_diff)
f <- 'data/Step05-go_enrich_results.Rdata'
if(!file.exists(f)){
go_enrich_results <- lapply( g_list , function(gene) {
lapply( c('BP','MF','CC') , function(ont) {
cat(paste('Now process ',ont ))
ego <- enrichGO(gene = gene,
universe = gene_all,
OrgDb = org.Hs.eg.db,
ont = ont ,
pAdjustMethod = "BH",
pvalueCutoff = 0.99,
qvalueCutoff = 0.99,
readable = TRUE)
print( head(ego) )
return(ego)
})
})
save(go_enrich_results,file = 'data/Step05-go_enrich_results.Rdata')
}
load(file = 'data/Step05-go_enrich_results.Rdata')
n1 <- c('gene_up','gene_down','gene_diff')
n2 <- c('BP','MF','CC')
for (i in 1:3){
for (j in 1:3){
fn <- paste0('figures/Step05-GO_dotplot_',n1[i],'_',n2[j],'.png')
cat(paste0(fn,'\n'))
png(fn,res=150,width = 1080)
print(dotplot(go_enrich_results[[i]][[j]]))
dev.off()
}
}
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随便选了一张
3.GSEA官网：https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp
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GSEA与别的差异分析相比，它保留了一些差异并不显著但是功能显著的基因，包容性更强，他不需要进行差异分析，他的输入数据是基因集genelist（并不是单个基因）和基因差异表达情况（可以是前面分析好的logFc值）
MSigDB:收集基因集的数据库，有八大类基因集
• H: hallmark gene sets该类别包含了由多个已知的基因集构成的超基因集，每个H类别的
基因集都对应多个基础的其他类别的基因集。
• C1: positional gene sets该类别包含人类每条染色体上的不同cytoband区域对应的基因集合。根据不同染色体编号进行二级分类。
• C2:curated gene sets
• 该类别包含了已知数据库，文献和专家支持的基因集信息。
• C3 : motif gene sets该类别包含了miRNA靶基因和转录因子结合区域等基因集合。
• C4 : computational gene sets 计算机软件预测出来的基因集合，主要是和癌症相关的基因。
• C5 : GO gene sets该类别包含了Gene Ontology对应的基因集合
• C6 : oncogenic signatures该类别包含已知条件处理后基因表达量发生变化的基因。
• C7 : immunologic signatures该类别包含了免疫系统功能相关的基因集合。
http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/genesets.jsp
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下面R中实现GSEA的分析：
rm(list = ls())
library(GSEABase)
library(clusterProfiler)
load(file = "data/Step05-DEG_ENTREZID_for_GSEA_GSVA.Rda")
geneList <- DEG$log2FoldChange
names(geneList) <- DEG$ENTREZID #对genelist赋值
geneList <- sort(geneList,decreasing = T) #从大到小排序
## 如果存在之前分析后保存的结果文件，就不需要重复进行GSEA分析。
f <- 'data/Step06-gsea_results.Rdata'
#选择gmt文件（MigDB中的全部基因集）
d <- 'MsigDB/'
gmts <- list.files(d,pattern = 'all')
gmts
if(!file.exists(f)){
gsea_results <- lapply(gmts, function(gmtfile){
# gmtfile=gmts[2]
geneset <- read.gmt(file.path(d,gmtfile))
print(paste0('Now process the ',gmtfile))
egmt <- GSEA(geneList, TERM2GENE=geneset, verbose=FALSE)
head(egmt)
return(egmt)
})
# 上面的代码耗时，所以保存结果到本地文件
save(gsea_results,file = f)
}
load(file = f)
#提取gsea结果，熟悉这个对象
gsea_results_list<- lapply(gsea_results, function(x){
cat(paste(dim(x@result)),'\n')
x@result
})
gsea_results_df <- do.call(rbind, gsea_results_list)
gseaplot(gsea_results[[6]],geneSetID = 1)
gseaplot(gsea_results[[6]], "PRC2_EZH2_UP.V1_UP")
gseaplot(gsea_results[[6]],geneSetID = 12)
可以看到是富集在左端并且呈现上调趋势
4.GSVA
GSVA分析原理:
• 基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis，GSVA），一种以非监督方式对一个简单群体评估通路活性变异的GSE方法。
• GSE基因集富集（gene set enrichment）方法通常被认为是一个生物信息学分析的终点，但是GSVA构成了一个构建以通路为中心的生物学模型的起点。
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### 对 MigDB中的全部基因集 做GSVA分析。
## 还有ssGSEA, PGSEA
### 读取基因表达矩阵
rm(list = ls())
options(stringsAsFactors = F)
load(file = "data/Step01-airway2exprSet.Rdata")
dim(exprSet)
table(group_list)
library(limma)
library(edgeR)
dge <- DGEList(counts=exprSet)
dge <- calcNormFactors(dge)
logCPM <- cpm(dge, log=TRUE, prior.count=3)
logCPM[1:4,1:4]
X <- as.data.frame(logCPM)
## Molecular Signatures Database (MSigDb)
d <- 'MSigDB'
gmts <- list.files(d,pattern = 'all')
gmts
library(ggplot2)
library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
library(GSVA)
keytypes(org.Hs.eg.db)
# 如果ENSG的ID具有小数点，用下面两句代码舍掉小数点
# library(stringr)
# rownames(DEG) <- str_sub(rownames(DEG), start = 1, end = 15)
X$ENSEMBL <- rownames(X)
# bitr in clusterProfiler
df <- bitr( rownames(X), fromType = "ENSEMBL", toType = c( "ENTREZID" ), OrgDb = org.Hs.eg.db )
head(df)
df <- unique(df, by = "ENTREZID")
X <- merge(X, df, by='ENSEMBL')
head(X)
dim(X)
X <- cbind(X[ncol(X)], X[-c(1,ncol(X))])
X <- avereps(X, ID = X$ENTREZID)
rownames(X) <- X[,1]
exp <- X[,2:ncol(X)]
f <- 'data/Step07-es_max.Rda'
if(!file.exists(f)){
es_max <- lapply(gmts, function(gmtfile){
#gmtfile=gmts[8];gmtfile
geneset <- getGmt(file.path(d,gmtfile))
es.max <- gsva(exp, geneset,
mx.diff=FALSE, verbose=FALSE,
parallel.sz=1)
return(es.max)
})
save(es_max, file = f)
}
adjPvalueCutoff <- 0.001
logFCcutoff <- log2(2)
f <- 'data/Step07-gsva_msigdb.Rda'
if(!file.exists(f)){
es_deg <- lapply(es_max, function(es.max){
table(group_list)
dim(es.max)
design <- model.matrix(~0+factor(group_list))
colnames(design)=levels(factor(group_list))
rownames(design)=colnames(es.max)
design
library(limma)
contrast.matrix<-makeContrasts(paste0(unique(group_list),collapse = "-"),
levels = design)
contrast.matrix<-makeContrasts("trt-untrt",
levels = design)
contrast.matrix ##这个矩阵声明，我们要把progres.组跟stable进行差异分析比较
deg = function(es.max,design,contrast.matrix){
##step1
fit <- lmFit(es.max,design)
##step2
fit2 <- contrasts.fit(fit, contrast.matrix)
##这一步很重要，大家可以自行看看效果
fit2 <- eBayes(fit2) ## default no trend !!!
##eBayes() with trend=TRUE
##step3
res <- decideTests(fit2, p.value=adjPvalueCutoff)
summary(res)
tempOutput <- topTable(fit2, coef=1, n=Inf)
nrDEG = na.omit(tempOutput)
#write.csv(nrDEG2,"limma_notrend.results.csv",quote = F)
head(nrDEG)
return(nrDEG)
}
re = deg(es.max,design,contrast.matrix)
nrDEG=re
head(nrDEG)
return(nrDEG)
})
gmts
save(es_max,es_deg,file='data/Step07-gsva_msigdb.Rda')
}
load(file = f)
library(pheatmap)
lapply(1:length(es_deg), function(i){
# i=2
print(i)
dat=es_max[[i]]
df=es_deg[[i]]
df=df[df$P.Value<0.01 & abs(df$logFC) > 0.3,]
print(dim(df))
if(nrow(df)>5){
n=rownames(df)
dat=dat[match(n,rownames(dat)),]
ac=data.frame(g=group_list)
rownames(ac)=colnames(dat)
rownames(dat)=substring(rownames(dat),1,50)
pheatmap::pheatmap(dat,
fontsize_row = 8,height = 11,
annotation_col = ac,show_colnames = F,
filename = paste0('figures/Step07-gsva_',strsplit(gmts[i],'[.]')[[1]][1],'.png'))
}
})
adjPvalueCutoff <- 0.001
logFCcutoff <- log2(2)
df <- do.call(rbind ,es_deg)
es_matrix <- do.call(rbind ,es_max)
df <- df[df$P.Value<0.01 & abs(df$logFC) > 0.5,]
write.csv(df,file = 'data/Step07-GSVA_DEG.csv')
最后得到的结果
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