日常瞎掰
ChIP-seq可以用来研究某种转录因子或者组蛋白(后面统称为蛋白因子吧)在基因组上的结合位置，从而来确定蛋白因子可能调控的靶基因，继而推测出在生物过程中的相关调控功能。既然是用来研究某种特定的蛋白因子，所以ChIP-seq在建库时就会用到相对应的抗体来结合蛋白因子，从而特异性地富集蛋白因子结合的DNA片段。因此，ChIP-seq实验成功与否的关键在于抗体结合的特异性，如果特异性不好，可能捕获到的背景DNA片段就会很多，信号就不强，从而影响后续的分析结果。只有当特异性好了才能富集到我们想要的DNA片段，从而得到想要的分析结果。那么，当ChIP-seq实验完成后，我们如何从数据的角度得知富集的好坏呢？今天我们就来聊聊ChIP-seq数据质控方面的事。
富集
富集可以用来考量在噪音中的信号是不是随机现象。那么，一个简单的办法来衡量信号是否富集就是可以看信号与噪音的比例，简称信噪比。ChIP-seq的数据在建库过程中有靶向捕获的过程，那么如何来判断这个富集好坏呢？可以通过下面的图Fingerprints来评估信号的富集情况。
plotFingerprint \
-b *bam \
--labels H3K27me3 H3K4me1 H3K4me3 H3K9me3 input \
--minMappingQuality 30 --skipZeros \
--region 19
--numberOfSamples 50000 \
-T "Fingerprints of different samples" \
--plotFile fingerprints.pdf \
--outRawCounts fingerprints.tab
结果如下：
上面就是Fingerprints图，该如何解读这个图呢？首先，我们要明白这个图是如何得到的。ChIP-seq的数据是富集想要的DNA片段，如果富集效果好的话，这些DNA片段大部分应该来自蛋白因子在基因组上的结合位置，也就是说大部分的reads会比对到特定的基因组位置上。这样的话，这些位置的reads覆盖度就要比背景区域高。所以，如果将基因组划分为特定大小的bin区间，然后统计每个bin的覆盖度。那么，含有蛋白因子结合位置的bin的覆盖度就会比较高。这样所有bin覆盖的reads加起来就相当于文库的总reads数。最后，将这些bin按照覆盖度从小到大排序，分别统计reads和bin的累积占比。
如此，将得到的reads数累积比例做为上图的横坐标，bin个数累积比例做为上图的纵坐标。现在知道了这个图的来历，那么，就可以来解读这个图了。例如，下图中的灰色和绿色参考线分别指向纵坐标和横坐标的0.55和0.97。那么，我们就可以知道97%的bin所覆盖的reads占总文库reads的55%，也就是剩余45%的reads覆盖到其余3%的bin里面。如果富集特异性效果好，大部分高覆盖度的bin应该都是来自蛋白因子所结合的位置，这些位置对应的bin所覆盖的reads比例越高，则富集性越好。由此，可知下图中蓝色曲线可以说明H3K4me3的富集很好。其实，简单来说就是曲线的拐点越靠近右下角则富集性越好。当然，这个图还可以提供额外的信息就是有多少基因组位置没有reads覆盖。如下图的横坐标没有从0开始，起点位置是0.1，这说明有10%的基因组位置没有reads覆盖。
分布
一般蛋白因子在基因组的结合位置取决于其类型，如转录因子一般结合在基因上游的TSS区域，而组蛋白一般结合在基因body区域。所以，为了评估富集的DNA片段是否符合实际情况，可以通过下面的profile和heatmap图来评估。
- scale-regions
computeMatrix scale-regions -S sample.bw \
-R genes.bed \
-b 3000 \
--regionBodyLength 6000 \
-a 3000 \
--skipZeros -o matrix.mat.gz
plotProfile -m matrix.mat.gz -o sample.profile.pdf
plotHeatmap -m matrix.mat.gz -o sample.heatmap.pdf
- reference-point
computeMatrix reference-point --referencePoint TSS \
-S sample.bw \
-R genes.bed \
-b 3000 \
-a 3000 \
--skipZeros -o matrix.mat.gz
plotProfile -m matrix.mat.gz -o sample.profile.pdf
plotHeatmap -m matrix.mat.gz -o sample.heatmap.pdf
TSS图的referencePoint参数有三个可选值：TSS，TES，center。关于profile和heatmap图绘制的帖子有很多，这里小编就不详细介绍了。其实，这两种图概述的信息差不多，都可以得知富集的区域在基因周边的位置，只不过heatmap提供了更为详细的信息，即每一个基因周边位置的富集情况。
结束语
Fingerprints可以直观地展示数据的富集情况，从而让我们可以知道数据的整体富集情况，做到心中有数。当然，像这样的QC只是做为一个参考，并没有严格的标准来定义数据是否可用。毕竟，科研数据已经产生了，谁又会大方的直接舍弃呢，但凡有一点信号能用到文章里面就是有价值的。不过，话说回来，虽然没有必要追求数据质量，但数据质量高得出的结论也更有可信度。看过数据富集情况后，然后再审视一下profile和heatmap图，基本就可以知道数据的整体质量如何了。啰嗦一下，以上提到的绘图过程都是用deeptools软件的功能完成的，这个软件的功能还是很强大的，值得拥有~~~
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