之前的文章中有提过使用Q5定点突变试剂盒消除突变，但是结果显示此试剂盒并没有很好的效果，随后使用2步PCR法移除突变序列。
原理是在突变片段的F链前段与R链末端设计一对引物，我的设计的是F4与R4。还有一对引物是基因全序列引物 F与R 。随后以我的突变质粒C5为模板，以引物F+R4；R+F4配对做2管PCR，
image.png
2 进行胶回收，
3 然后用这两个产物（150ng）同时进行PCR引物为F，R，
反应体系为：
FR4： 150ng
RF4： 150ng
2*Mix： 25ul
F：2ul
R：2ul
用水补齐到150ul
4 胶回收，切去全长序列对应的条带纯化，然后使用内切酶切取粘性末端，
5 与目标质粒进行连接（如之前的文章，表达质粒的构建）
PS：为什么不直接使用cDNA与全长引物来重新获取目标片段，因为有些长片段本来就容易突变，这种2段法有效的减少了这种突变，所以就是用这种方法构建。
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本文标题：两步PCR法切除突变片段
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