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背景
肺腺癌(LUAD)是非小细胞肺癌最常见的亚型。此外，双硫死亡作为一种新发现的细胞死亡类型，被发现与肿瘤的发生和发展密切相关。
方法 通过相关分析，首次鉴定出与双硫死亡相关的基因。然后利用单变量cox回归和LASSO回归筛选这些基因，并通过多变量cox回归构建预后模型。还创建了一个列线图来预测LUAD的预后。该模型在GSE72094、GSE31210和GSE37745三个独立的数据集上进行了验证。然后根据中位风险评分对患者进行分组，分析两组间差异表达基因。同时进行富集分析、免疫浸润分析和药物敏感性评价。
结果 在本研究中，作者检测了21个与双硫死亡相关的基因，并发现了一个与LUAD预后较差相关的基因标签。本研究的模型使用三个独立的数据集进行了验证，显示在1年、3年和5年的AUC值大于0.5。富集分析显示，双硫死亡相关基因对LUAD具有多方面的影响，特别是与肿瘤的发展、增殖和转移有关。高危组患者肿瘤纯度较高，基质评分、估计值、免疫评分较低。
结论 本研究构建了肺腺癌双硫死亡相关基因标签，分析其对肺腺癌的影响及其与肿瘤微环境的关系。本研究的发现为理解肺腺癌提供了有价值的见解，并可能导致新的治疗策略的发展。
图 1 本研究的工作流程
研究结果
双硫死亡相关基因的筛选
在本研究中，通过查阅文献，作者确定了9个与双硫死亡相关的基因。此外，我们进行了单基因相关分析，鉴定出465个相关基因。进一步进行了单变量cox回归分析并筛选出138个基因。最后，利用LASSO回归分析，确定了21个惩罚系数为非零的基因(图2A和2B)。这些基因包括VAMP8、EIF5A、ATP5MD、SEC61G、TM9SF3、RHOC、PFDN1、JAGN1、SELENOK、PSMA4、ACSL3、RPE、TNPO1、CCM2、TMOD3、CHCHD4、ATG16L2、ZNF589、NEIL3、MYOZ1、BCAN。
图 2 本研究使用TCGA队列建立了一个预后风险评分模型。
双硫死亡相关基因预后特征的构建
用21个基因构建多元cox回归模型。将每个基因的mRNA表达水平乘以其各自的多变量Cox回归系数，得到加权表达水平。每个基因加权表达水平的总和产生了个体预后风险评分。使用中位风险评分，在TCGA队列中，患者被分为高风险(n = 232)和低风险(n = 232)组。高危组的总生存期(OS)明显低于低危组(HR, 1.4 (1.3-1.5;p < 0.0001))。采用ROC曲线评估DRGs特征，该曲线在预测OS方面具有良好的性能和效率。1年、3年和5年生存率的AUC值分别为0.747、0.714和0.692(图2D)。使用校准曲线进一步评估了DRGs特征，结果显示观察结果与3年和5年生存率的预测生存率之间有良好的一致性(图2E和2F)。这些结果证明了我们的DRGs特征在预测LUAD患者不良预后方面的稳健性。
图 2 本研究使用TCGA队列建立了一个预后风险评分模型。
在三个独立的GEO数据集上对DRGs特征进行了验证，结果与TCGA数据集一致。与低危组相比，高危组患者的死亡率更高，生存预后更差，见图3。总的来说，DRGs特征能有效预测肺腺癌患者的生存结局。
图 4 模型在三个独立的数据集上进行了验证。
双硫死亡相关基因标签是LUAD的独立预后因素
为了确定肺腺癌患者的独立预后因素，我们进行了多因素Cox回归分析。分析包括双硫死亡相关风险评分和临床特征，如年龄、性别、分期和初级诊断。结果表明，风险评分(HR = 2.6, 95% CI 1.8-3.6)是LUAD患者OS的独立预后因素(图2G)。作者开发了一个临床预后诺姆图，通过考虑年龄、病理分期和风险评分来预测LUAD患者的1年、3年和5年OS（图4A）。使用ROC分析评估列线图的性能和效率，其导致1年、3年和5年生存率的AUC值分别为0.704、0.700和0.690（图4B）。病理分期和风险评分（图4A）。使用ROC分析评估列线图的性能和效率，其导致1年、3年和5年生存率的AUC值分别为0.704、0.700和0.690（图4B）。校准曲线用于评估基于诺姆图的预测模型的准确性。3年和5年的校准曲线与45度对角线紧密对齐，表明在TCGA-LUAD队列中预测和观察到的生存概率之间非常一致(图4C和4D)。
图 4 在TCGA队列中构建诺姆图。
高危与低危人群差异基因分析
作者利用Deseq 2包来分析高风险和低风险患者之间的差异基因，导致鉴定出1012个差异基因（调整的p < 0.05 & abs（log FC）>1），其中375个上调基因和637个下调基因（图5A和5B）。随后，作者对差异基因进行了GO和KEGG富集分析。GO条目主要集中在细胞周期、增殖、凋亡、迁移、侵袭、肿瘤微环境和免疫反应(图5C)。KEGG分析结果表明，神经活性配体-受体相互作用、细胞色素P450对异种生物的代谢、补体和凝血级联反应、酪氨酸代谢等途径可能与肺腺癌的发生发展有关(图5D)。这些通路涉及肿瘤微环境、细胞间信号转导、DNA损伤和突变、炎症和血管生成等方面。
图 5 TCGA队列中高、低风险评分患者差异表达基因的分析。
利用GSEA对TCGA-LUAD队列进行HALLMARKS基因集富集分析(图6A)。研究结果以气泡图的形式呈现，突出显示了被选择并单独显示的重要路径。唯一激活的途径是Hallmark同种异体移植排斥反应，主要与器官移植排斥反应相关(图6B)。该途径涉及免疫细胞和细胞因子，如T细胞、B细胞、巨噬细胞和细胞因子(如IFN-γ、IL-2、IL-4等)。三个最显著的抑制途径是HALLMARK E2F靶标、HALLMARK上皮间充质转化和HALLMARK G2M检查点(图6C)。HALLMARK E2F靶点和HALLMARK G2M检查点参与调节细胞周期，并与肿瘤的发展密切相关。HALLMARK上皮间充质转化通路与肿瘤的迁移和侵袭密切相关。
图 6 在TCGA队列中进行GSEA富集分析。
使用GSVA R软件包对TCGA-LUAD队列进行功能注释，选择了GSVA-KEGG结果中变化最大的20条路径，并用热图显示(图6D和6E)。肿瘤细胞增殖的途径包括细胞周期、DNA复制和嘧啶代谢。同时，剪接体、蛋白酶体、泛素介导的蛋白水解等途径参与RNA剪接、信号转导以及细胞凋亡等过程的调控。与低风险患者相比，这些通路在高危患者中被发现显著激活。此外，还通过GSEA确定了与免疫系统相关并参与移植排斥的同种异体排斥途径。与低危患者相比，高危患者参与肿瘤细胞侵袭和迁移的细胞粘附分子(Cell adhesion molecules, CAMs)通路受到明显抑制。综上所述，本研究发现高危和低危患者细胞增殖、肿瘤迁移、侵袭相关通路发生了显著变化。
图 6 在TCGA队列中GSVA富集分析
探讨双硫死亡相关基因标签与肿瘤微环境的关系
在本研究中，作者使用ESTIMATE和ssGSEA算法研究了LUAD患者的DRGs信号与肿瘤微环境之间的关系。研究结果显示，高危组肿瘤纯度高于低危组，而基质评分、ESTIMATE评分、Immune评分则相反，三者之间差异有统计学意义(图7A、7B、7C、7D)。此外，ssGSEA分析显示多种抗肿瘤免疫细胞类型显著减少，包括适应性免疫细胞(活化的B细胞，活化的CD8 + T细胞和1型T辅助细胞)和固有免疫细胞(嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、细胞、单核细胞、自然杀伤细胞和浆细胞样树突状细胞)(图7E, 7F, 7G)。提示高危组肿瘤可能存在免疫抑制微环境，该微环境可削弱抗肿瘤免疫功能，促进肿瘤生长。
图 7 TCGA队列中差异表达基因的免疫浸润分析
化疗反应预测和双硫死亡相关基因标签
利用pRRpphetic软件包预测属于不同风险组的LUAD患者各种化疗药物的IC50(图8)。研究发现，低风险组的IC50估计显著较低，如VX.702 (p38 MAPK抑制剂)、CCT007093 (PPM1D抑制剂)、PD.0332991 (CDK4/6抑制剂)、Nutlin.3a (MDM2抑制剂)，LFM.A13(布鲁顿酪氨酸激酶(BTK) inhibitor)、DMOG (HIF脯氨酸羟化酶抑制剂)、来那度胺(免疫调节药物)、MK.2206 (AKT抑制剂)、PF.02341066 (ALK和c-Met抑制剂)、PAC.1 (Procaspase-3激活剂)、Nilotinib (BCR-ABL抑制剂)、GDC.0449 (Hedgehog信号通路抑制剂)、AZD6482 (PI3Kβ抑制剂)、EHT.1864 (Rac GTPase抑制剂)，Roscovitine (CDK抑制剂)和AZD6244 (MEK1/2抑制剂)。这表明这些药物可能对低CARGs风险评分的患者有潜在的好处。
图 8 TCGA队列中高、低风险评分组药物敏感性评价。
结论
在这项研究中，作者利用文献和单基因相关性分析来确定与双硫死亡相关的基因并对其进行筛选。最终，选取了21个与双硫死亡相关的基因构建了肺腺癌的预后模型，为患者的预后和诊断提供帮助。该模型在三个独立的数据集上进行了验证。此外，作者进行了富集分析和免疫浸润分析，以探讨该模型对肺腺癌增殖、转移和免疫微环境的影响。
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