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本文的思路是通过单细胞数据分析识别了某种免疫细胞特有的marker基因，然后利用这些基因进行预后模型的构建。事实上，预后模型的文章已经不好发了，甚至有的审稿人看到预后模型就反感，因为实在是太多了，而且预测效能普遍不行。那么如何做的比这篇文章还要好呢？鉴于最近泛癌分析以及肿瘤分型分析比较好发，小编做的免疫细胞marker的泛癌分析以及肿瘤分型，内容是这些文章的2倍以上，均发表到8+杂志。所以我们在筛选到某种免疫细胞特有的marker基因后，可以对这些基因进行泛癌分析或者肿瘤分型分析。在分型分析中再附上简单的预后模型，但不以其为重点。这样的思路肯定是比本篇文章内容更多，更新颖。如果想做类似分析，欢迎交流。
研究概述：
中性粒细胞是肿瘤中最丰富的免疫细胞群之一。本研究旨在研究非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤免疫微环境(Time)中复杂的通讯网络，通过分析中性粒细胞分化的特点，阐明免疫细胞与肿瘤之间的相互作用，建立预测患者免疫应答和预后的预后风险模型。在研究中，整合单细胞RNA采用NSCLC标本和大体积RNA-seq的序列分析(scRNA-seq)数据进行分析。作者鉴定了28个主要的细胞簇，并阐明了它们之间的相互作用。其次，作者发现4个不同阶段的中性粒细胞亚群，与免疫调节和代谢途径密切相关。根据4个管家基因(ACTB、GAPDH、TFRC、TURB)的比值，作者建立了MS4A7、CXCR 2、CSRNP 1、RETN、CD 177和LUCAT 1等6个中性粒细胞分化相关基因(NDRGS)预后风险模型，并对患者的总生存期和免疫治疗反应进行了成功预测和验证。最后，本研究探讨了6个预后基因导致NSCLC预后不良的原因，筛选了针对预后基因抗肿瘤效应的小分子化合物。
研究结果：
一、细胞类型的鉴定
1.所有细胞通过标准程序被聚类为28个簇，并被进一步标注为10种细胞类型（图1A和B）。分别对淋巴免疫细胞群（T细胞、B细胞、浆细胞）、髓免疫细胞群（单核细胞、树突状细胞）和上皮细胞/癌细胞进行进一步的亚群聚类。T淋巴样免疫细胞簇进一步分为14个簇，通过注释确定了七个主要子组。（图1D和E）髓系免疫细胞被分为15个细胞簇，确定了7个主要亚群（图1F和G）。
2.分析正常上皮细胞，获得18个细胞簇，确定了九个主要的亚组（图1H和I）。28种细胞类型的标记基因表达水平如图所示。
二、TIME中的信号网络研究
1.作者在TCGA队列中注释了上述28个细胞，显示了细胞丰度的比例（图2A）。患者尤其是肿瘤患者的中性粒细胞含量明显高于正常人，可能与肿瘤中中性粒细胞的促瘤和抑瘤特性有关。
2.随后，基于28个细胞簇对微环境中的细胞相互作用网络进行了分析（图2B）。
三、中性粒细胞的不同分化特点
1.使用Monocle进行伪时间轨迹中性粒细胞亚群分析。中性粒细胞被分为四种不同的分化阶段（图3A和B），NDRGs具有高度的突变性和异质性，提示NDRGs在中性粒细胞诱导肿瘤发生和发展中起着关键作用。（图3I和H）
2.随后，进行GSEA（图3C-F）。作者发现了四种不同的中性粒细胞分化阶段及其NDRGs的高致突变性和异质性。
四、建立稳定有效的预后风险模型
1.为了构建预后风险模型，作者将TCGA队列分为训练集（n=731）和内部验证集（n=283），并将GEO队列（n=80）分为外部验证集。此外，NDRGs和DEGs（图4A）被交叉（图4B），交叉的基因被用来建立预后风险模型。8个与预后相关的关键基因被识别（图4C和D），通过多变量Cox回归分析确定了6个稳定的重要预后基因（图4E）及其回归系数并验证。按风险评分分组的三个队列的生存率差异显著，表明风险评分可作为患者预后的预测指标。（图4F-H）
2.使用预后特征建立列线图（图4I）。刻度曲线1年、3年和5年生存率显示实际生存率和列线图预测的生存率之间重叠度高（图4J）。
五、预后风险模型的免疫预测及临床应用
1.ssGSEA结果发现，高危组大部分免疫细胞的含量明显低于低危组，高危组免疫预后较差。（图5A）
在比较了6个预后基因在预测NSCLC患者免疫应答中的表现后，作者研究了临床特征与风险评分之间的关系。年龄和分期显著相关（图5C-H）。单因素Cox回归和多因素Cox回归分析显示风险评分与预后显著相关。（图5I），多变量Cox结果也证明风险评分是非小细胞肺癌的独立预后因素。（图5J）
六、探索六个预后基因的功能
1.作者进一步探讨了六个预后基因的表达、生存和途径改变。首先，对于MS4A7，它在肿瘤中被下调，而MS4A7的低预后预测更差（图6B）。GSVA低表达后的结果表明MS4A7参与各种免疫和抗炎反应（图6H）。同样，CXCR2在肿瘤组织中以低水平表达（图6A），低表达的CXCR2的预后更差（图6D）。
2.在CXCR2低表达后，发现细胞因子和细胞钙离子稳态等免疫活动相关途径也表现出下调状态（图6I），LUCAT1参与了促进NSCLC发生和发展的各种过程（图6A和C）。在LUCAT1过度表达之后，大多数生物代谢途径，包括与癌症相关的途径显著增加（图6J），相反，CD177基因在肿瘤组织中高度表达（图6A）。在高表达后，预后相对更好（图6G）。在过度表达后，发现IL-17信令通路等信号通路的活性显著上调（图6K），CD177与大多数免疫细胞的丰度呈正相关。此外，肿瘤组织中的CSRNP1和RETN被下调（图6A），但两者的下调预测水平更好（图6E和F），它们和大多数免疫细胞的丰度呈正相关。
3.在CSRNP1低表达后，发现许多转录相关途径的活性下降，包括剪接体snRNP assem-bly（图6L）。RETN低表达后，发现Chemokine信号通路和Neutro-phil相关通路的动动关系明显下调（图6M）。
七、预后基因的小分子化合物对接
使用CTD数据库的筛选，Autodock分子对接和药物毒理学研究确定了5种靶向预后基因的药物。雌二醇能够与MS4A7紧密结合并上调MS4A7 mRNA表达，其分子对接的模拟结合能为-4.23（kcal/mol）。（图7A）改善CXCR2mRNA表达增加的小分子化合物中，Abrine 的最佳对接结合能为− 4.58 （kcal/mol） （图 7B）离奥霉素可以有效地结合RETN并增加其mRNA表达水平，高水平结合能为-7.91（kcal/mol）。（图7C）倍氯米松在寻找增强CSRNP1表达的小分子化合物时表现出-10.97（kcal/mol）的高水平对接结合能（图7D）。在筛选上调CD177 mRNA的小分子化合物时，XL147分子对接结合能最高，为−8.36（kcal/mol）（图7E）。
研究总结：
在这项研究中，作者结合了两个scRNA-seq数据来说明TIME中的复杂细胞通信网络，并表征了中性粒细胞的不同分化阶段和NDRG。作者建立了一种预后风险模型，该模型可用于预测患者的预后表现和免疫治疗效果。最后，该研究讨论了预后基因导致预后不良的原因，并筛选药物是否存在预后基因，从而为靶向治疗提供了新的见解。
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