HALO助力默克尔细胞癌（MCC）
多维定量评估
随着技术手段的不断更迭，肿瘤微环境和异质性与免疫、靶向治疗的关系已成为科研的前沿热点。非因生物致力于空间多组学技术的结合，采用兴趣点策略（Region of Interest ROI），运用数字空间多组学技术（DSP）获得样本空间精细亚结构的多组学表达谱，结合多重免疫荧光和HALO人工智能方法获得单细胞水平数据，根据多组学信息和临床表征，开展高维度肿瘤微环境的研究。
HALO系统可以提供高精准的、超性能的、可扩展的、稳定的病理学分析，其强大优势在于能够提供微环境组织中以细胞为单位的形态学和多重表达数据的报告，并保持细胞数据和空间信息的链接。目前已经逐步用于全世界的科研，生物制药、医疗保健领域。
2018年发表在《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》杂志上（IF：9.913）的文章“Multidimensional, quantitative assessment of PD-1/PD-L1 expression in patients with Merkel cell carcinoma and association with response to pembrolizumab”（图1），利用免疫组织化学/免疫荧光（IHC / IF）对预处理的FFPE肿瘤标本进行染色，然后利用HALO强大的数字图像分析功能，发现MCC患者中PD-1+ 和 PD-L1+细胞的密度以及它们之间的相互作用与临床反应相关，为预测生物标记物提供了新思路。
图1
研究背景
默克尔细胞癌（Merkel Cell Carcinoma，MCC）是一种罕见的侵袭性皮肤癌，多与紫外线照射和默克尔细胞多瘤病毒（MCPyV）有关。由于肿瘤通常会表达程序性死亡受体-配体1（PD-L1），并与T细胞表面的程序性死亡受体1（PD-1）结合实现免疫逃逸，因此阻断PD-1免疫抑制通路受到了广泛关注。据报道，Pembrolizumab（全称帕普利珠单抗，是一种PD-1和PD-L1抑制剂）作为MCC的一线治疗方法可使患者缓解率达56%，并且病毒阳性和病毒阴性肿瘤患者均能产生缓解。然而，预测临床反应的生物标志物尚未确定。
技术亮点
研究者借助HALO强大的数字图像分析功能，发现MCC患者中PD-1+ 和 PD-L1+细胞的密度以及它们之间的相互作用与临床反应相关。通过Multiplex immunofluorescence (多重免疫荧光)技术对其肿瘤微环境进行蛋白组多靶标分析验证。相比较其他病理图像分析软件，HALO具有友好、易操作的界面，能够提供快速、精准、详尽的数字病理全组织切片分析，极其适合肿瘤微环境与异质性的研究。
研究思路
该研究通过免疫组织化学/免疫荧光（IHC / IF）对预处理的26例（IIIB期或IV期MCC）患者的FFPE肿瘤标本进行染色，并对阳性细胞的密度和分布进行定量分析。然后利用多重IF（mIF）检测一组单独的MCC样本（n=16），以确定表达PD-1的细胞类型。最后通过HALO数字图像分析软件对切片进行扫描。研究发现，26例MCC患者中有17名对Pembrolizumab治疗表现出缓解现象（CR=5, PR=12），8名患者无缓解现象，1名患者仅出现了短暂的PR现象但未达到RECIST标准。
文章解读
首先病理学家对肿瘤边界进行了注释，并将其包围的区域称为肿瘤内部(IT)。癌旁(PT)区域位于肿瘤边界外100μm处，均由HALO进行标注（图2）。将每平方毫米中显示CD8（棕色）、PD-1（绿色）、PD-L1（棕色）或NKp46的阳性细胞数作为IT、PT或TME (PT+IT)区域的连续变量进行评估。发现Pembrolizumab治疗无缓解组（NR）和完全缓解组（CR）各类细胞分布存在差异（图2B）。
图2 在高分辨率数字扫描的IHC / IF染色载玻片上标注肿瘤区域
为了对Pembrolizumab缓解组(R) 及无缓解组（NR）的细胞分布进行评估，以26名MCC患者样本为依据，进一步利用HALO软件对细胞进行定量统计。发现Pembrolizumab缓解组(R) PD-1+的中位密度(IQR)明显高于无缓解者(NR)（图3A，p<0.05），而CD8+的中位密度在缓解组与无缓解组中差异不明显（图3B，p>0.05），即CD8+和PD-1+细胞密度在MCC患者对Pembrolizumab的反应中并不是可互换的生物标志物，PD-1+细胞的密度与Pembrolizumab的反应相关。而且，缓解组的PD-L1+细胞IQR高于无缓解组, PD-L1+组织面积也高于无缓解组（图3CD）。
图3 PD-1+和PD-L1+细胞密度与Pembrolizumab的临床反应相关
研究者对细胞空间的关系做了进一步研究，利用HLAO Spatial Analysis模块，绘制PD-1+与PD-L1+细胞空间关系，计算每个PD-1+细胞（红点）与其最近的PD-L1+细胞(绿点)之间的距离，该距离在20μm以内的PD-1+细胞标为红点，并与PD-L1+细胞以黑线相连（图4A）。Pembrolizumab缓解者与未缓解者相比，与PD-L1+细胞相互作用的PD-1+细胞的中位数密度(±IQR)明显高于CD8+细胞（图4B，p<0.05）， 这说明邻近PD-L1+细胞的PD-1+细胞密度与Pembrolizumab的临床反应相关。
图4 邻近PD-L1+细胞的PD-1+细胞密度与pembrolizumab的临床反应相关
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