用于研究配体诱导GPCRs结构变化的二硫键交联策略
8.1 前言
GPCRs超家族是自然界中发现最大的细胞表面受体群。更好地理解GPCRs如何在分子水平上发挥作用，对于设计通过特定GPCR亚型调节信号传导的新型药物至关重要。许多不同的GPCRs的配体结合和G蛋白偶联结构域的结构特征已被广泛研究。此外，生物物理和生物化学研究为伴随光感受器视紫红质的激活而发生的构象变化提供了相当深入的见解。在这些研究中，大多数都是通过一系列受体溶解和纯化步骤得到突变型的视紫红质。然而，视紫红质的溶液状态的结构和动力学性质可能与在原生膜中发现的不相同。
与牛视紫红质可获得的丰富的结构信息相比，我们对其他GPCRs配体触发结合扩散(如神经传递素和激素)激活的分子事件序列知之甚少。虽然分子分辨率有限，但使用纯化的、突变修饰的beta-2-肾上腺素受体，基于荧光的生物物理研究已经检测到不同细胞内受体结构域的活性依赖运动。因此，有必要更详细地检测GPCR结构和受体构象中配体依赖的变化。理想情况下，用于此类研究的方法应该兼容原位受体。
为了解决这个问题，我们使用大鼠M3 muscarinic acetylcholine (ACh)受体(M3 mAChR)作为模型系统，这是一种I类GPCR原型。M3 mAChR激动剂的占位导致Gq家族G蛋白的优先激活，触发不同亚型的磷脂酶C的激活，进而产生第二信使二酰基甘油和肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)。为了监测配体诱导的M3 mAChR结构变化，我们开发了一种二硫键交联策略，可以检测受体三维结构中相邻的两个Cys残基之间的二硫键形成。这种策略的一个主要优势是，可以研究原位受体配体依赖的构象变化。在没有或有毒蕈碱配体时观察到的二硫键交联模式的差异可以指导有关配体诱导的构象变化的分子性质的预测。在之前的研究中，M3mAChR不活跃状态的3D模型辅助了这些预测，该模型是通过同源建模建立的，使用牛视紫红质的暗(不活跃)状态的高分辨率X射线结构作为模板。最近，一种高分辨率X射线结构的人肾上腺素受体结合部分逆激动剂(carazolol)已被报道。由于M3 mAChR与mg2 -肾上腺素受体相比具有更高程度的序列同源性，我们目前正在基于新解决的mg2 -肾上腺素受体结构的原子坐标改进我们的M3 mAChR模型。首先成功地利用Cys扫描诱变方法和氧化二超氧化物连接来研究细菌化学受体的结构。在随后的许多研究中，这一策略被用于探索牛视紫红质的天然(暗)结构，以及伴随光诱导视紫红质的活化的结构变化。
在绝大多数情况下，二硫键桥中半胱氨酸的碳原子间的距离在4.4 - 6.8 a之间。因此，一般的假设是：当两个碳原子的距离小于~ 7a时，两个Cys残基有可能形成一个二硫键(在适当的实验条件下)。
8.2 方法
8.2.1适于二硫交联研究的M3 mAChR改造
为了使M3 mAChR适于二硫键交联研究，受体蛋白被修改如下(也见图8.1)。在每一步之后，我们证实了引入的结构变化不会干扰配体结合和受体/G蛋白的偶联。一个HA表位标签被添加到受体蛋白的N端。2存在于3 mAChR细胞外N末端区域的5个Asn残基被Gln残基取代，这5个Asn残基被预测为N-连接糖基化的位点。这些点突变是为了防止异质糖基化引起的多重免疫反应的出现。第三细胞内环(i3环;A274-K469)被两个相邻的Xa因子卵裂位点取代。A274-K469的缺失有助于M3mAChR的免疫印迹检测，原因还不明了。
在下一步中，除了C140、C220和C532之外，所有剩余的Cys残基都被Ala或Ser取代，这取决于这两种氨基酸中哪一种在受体表达和功能上具有更好的耐受性。C140和c220被预测参与分子内二硫键，这对M3 mAChR的正常折叠的功能至关重要。在所有其它囊替换和结构修饰的基础上，C532被Ala、ser或其他几个氨基酸取代导致配体结合活性的显著损失。下面我们将这种突变后的M3mAChR称为M3(3C)-Xa受体。重要的是，M3(3C)-Xa受体表现出与野生型M3mAChR相似的配体结合亲和蛋白偶联特性。
8.2.2研究二硫键交联的一般策略
下一步，我们将Cys残基重新引入到M3(3C)-Xa受体中，一个Cys N端，另一个Xa cleavage因子的C端(图8.2)。无论是自发的，还是在氧化剂如Cu(II)-(1,10-phenanthroline)3(Cu- phen)或分子碘的存在下，当两个Cys残基在感受器的三维结构中相互面对时，它们有可能形成二硫键桥。在Xa因子裂解后，二硫桥将保持两个分离产物共价连接。因此，在非还原条件下，western blots会出现全长约为38 kD的受体带(图8.2)。
8.2.3活性依赖性构象变化总结
根据过去几年对双Cys突变体m3 mAChR的交联研究，我们使用图8.2中总结的方法分析了超过100个不同的双Cys突变体M3 mAChR。图8.3突出显示了我们通过Cys替代诱变所定位的位置。为了确保双Cys突变受体被正确折叠，所有受体都在COS-7细胞中短暂表达，并在放射性寡聚和结合试验中研究它们结合激动剂和拮抗剂配体的能力。此外，为了确认不同的替代没有干扰受体介导的G蛋白激活，所有双Cys突变受体检测了它们刺激激动剂介导的磷酸化肌醇水解的能力。我们进行的一个关键观察是，muscarinic激动剂促进了C532(根据ballesteros - weinstein对GPCRs的命名法，位置为7.42)和位于151位的Cys残基(位置为3.36)之间的二硫键的形成(图8.3)。结合M3 mAChR失活的3D模型，该观察结果支持了这样一个观点，即激动剂M3 mAChR的激活会使跨膜结构域(TM)的细胞外部分相互靠近(图8.4a)。这可能是一个早期构象事件，触发了随后在细胞内受体表面G蛋白偶联的结构变化。通过对受体细胞质侧大量含有Cys置换的突变体M3 machrs2的分析，我们发现了九倍的Cys mutant受体，它们在激动剂的存在下显示出了增加的二硫键交联(图8.3)。另一方面，在两个被研究的双Cys突变受体中，激动剂给药破坏了二硫键的形成(A91C/ t549c和F92C/F550C [20];图8.4)。根据这些交联数据和M3 mAChR的三维模型，激动剂结合预计会导致M3受体细胞内表面的以下结构变化(图8.4b,c):
1 TM VI的细胞质端发生旋转运动，并靠近TM V的相应部分，这种运动类似于其他I类GPCRs的运动，包括视紫红质和2-肾上腺素受体。
2 TM VII的细胞质端向TMI相应区域移动，伴随着TM VII的旋转运动。
3螺旋8的N端部分远离TM I的细胞质端。有趣的是，在同样的研究中，我们证明了反向肌电激动剂增加了螺旋VIII和TMI细胞质端之间的接近度。
这些观察结果为毒蕈碱激动剂和反激动剂的相反生物效应提供了结构基础。最可能的是，上述激动剂诱导的构象变化揭示了之前无法触及的受体表面或残基，这些受体表面或残基能够高亲和力和高选择性地识别G蛋白，最终触发G蛋白的活化。
8.2.4细胞培养、转染及膜制备
所有的二硫键交联研究都是在短暂表达不同受体结构的cos -7细胞制备的膜上进行的。
8.2.5二硫交联前膜的尿素处理
为排除双Cys突变受体形成分子内二硫键，后者会间接造成配体诱导受体/
G蛋白复合物解离,建议使用高浓度尿素处理含有受体的膜。
8.2.6二硫键交联和通过Xa因子水解受体和western blotting检测二硫键
为了促进二硫键的形成，从表达受体的COS-7细胞膜中制备得到的受体被置于氧化条件下。随后，受体蛋白被Xa因子水解，随后进行western blotting研究以检测二硫键的形成。
8.3一般考虑、注意事项和故障排除
•每个实验都应包括空载体转染的COS-7细胞，以排除任何非特异性信号。此外，在所有交联实验中，必须将M3(3C)-Xa受体作为对照。最重要的是，Xa因子处理后的含M3(3C) Xa样本中缺少全长受体证实了Xa因子消化是完整的。为了正确解释阴性数据(缺乏二硫交联)，还建议包括采用除了Xa因子消化步骤之外的上述交联方案所有步骤的受体样本。通常，western blotting会显示这些样本中含有可检测到的全长受体蛋白，从而证实Xa因子消化后缺乏双硫代连接信号不是由非常少的受体蛋白引起的。
•在我们之前的大部分研究中，在含受体的膜制备中，我们使用Cu-Phen作为氧化剂来诱导二硫键的形成。虽然这种试剂促进二硫代物质形成的机制尚不清楚，但它被认为涉及Cu2+的短暂还原为Cu+。当在高浓度下使用时，Cu-Phen可能诱导非天然构象蛋白的二硫键交联。因此，如果可能的话，我们建议使用相对低浓度的Cu-Phen (2.5-100 mol/l)。
•所有双硫链连接方法都需要注意的是，负面结果很难解释。众所周知,二硫键的形成速度不仅取决于两个半胱氨酸残基之间的距离，还受它们的相对取向和半胱氨酸残基所处的环境所影响。因此，即使在强氧化条件下，尽管两个Cys残基在受体的三维结构中彼此接近(碳原子间的距离< 7a)，也可能不容易形成二硫键。
•还观察到，在受体的3D结构中，两个碳原子(如>7a)被预测相距相对较远的残基可以被二硫键桥连接。当Cys残基包含在构象灵活性高的受体区域时，就可以形成这种交联。与这一观点相一致的是，用已知结构的细菌化学受体的阳离子取代的二硫键交联研究表明，当两个C型碳原子相距小于~ 12时，二硫键很容易形成。构造和生物物理证据表明，GPCRs的细胞内表面，包括C端尾部和i3环，具有高度的结构灵活性。鉴于在最后两点中概述的警告，在解释由少量双Cys突变受体获得的交叉链接数据时，应特别谨慎。强烈建议用Cys逐个替换感兴趣的两个受体区域的连续残基，进行Cys扫描。氧化交联分析的结果收集双Cys受体可能提供一个更全面的动态变化与受体激活。
•在某些实验条件下，用较小的氧化剂(如分子碘)代替Cu-Phen可能是有利的。在我们之前的一项研究中，我们观察到，毒蕈碱配体阻止了Cu-Pheno催化TM VII L77位Cys残基与C532之间形成二硫键。我们推测，这种现象是由于毒蕈碱配体与相对庞大的Cu-Phen部分竞争进入亲水性结合位点所致。尽管Cu-Phen络合物催化二硫键形成的机理尚不清楚，但以前的研究表明，Cu-Phen催化二硫键的形成不需要生成过氧化氢作为氧化中间体。这个观察结果与概念(但没有证明)是一致的，即Cu-Phen络合物必须出现在链的直接附近才能交联。值得注意的是，当我们使用分子碘(其分子尺寸小于2.7 A)代替Cu-Phen作为氧化剂时，在L77C和C532之间观察到的二硫交联效率并没有受到毒菌烯配体的显著影响。因此，我们建议在涉及到存在于配体结合位点附近的残基交联研究中使用分子吡啶或其他小型氧化剂。可以连接邻近Cys残基的汞(II)盐(HgCl2)也被成功用于实现埋藏在TM受体核心中的Cys残基之间的连接。
•二硫键交联可以通过捕获相当短暂的受体构象(例如，介于受体的基态和完全活跃状态之间的构象)而发生，在这种构象中，两个Cys残基在受体的三维结构中暂时靠近彼此。相比之下，大多数生物物理学方法，包括定点自旋标记技术和使用荧光报告分子的研究，只能提供关于受体平均构象的信息。因此，这两种不同的技术产生的结果在本质上是互补的。
•与其他GPCRs一样，M3mAChR已知可形成二聚体或寡聚物。因此，确认与特定的双Cys突变受体观察到的二硫键交联是由于单分子内分而不是分子间二硫键是很重要的。我们已经多次使用的一种实验方法来解决这个问题，那就是共同表达分别包含两个Cys替换的不同突变受体。如果在双Cys突变受体上观察到的二硫键交联是由于分子内二硫键桥的形成，那么在两个单Cys突变受体共转染后将观察不到交联信号。
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