一、bowtie2的基本概念

1. 比对

全局比对 End to end，也叫双端比对。把read作为一个整体，不可分割断裂。

image.png

局部比对local alignment example，把reference作为整体，read可以分割。

image.png
bowtie2默认全局比对，也称作 "untrimmed " or "unclopped" alignment 。就是认为read是完整的，看看能对上哪些reference。

2. 比对计分

规则还没搞懂。慢慢琢磨。。。。

3.参考索引还可以自己建立

索引可以直接从官网下载（昨天学习到了），也可以自己构建
bowtie2-build <fasta文件> <要生成的索引文件前缀名>
类似下面的代码，但是这个过程大约要1-4小时，很耽误时间，一定要后台运行——服务器上要通过脚本提交。

ref=~/refdata-gex-GRCh38-2020-A/fasta/genome.fa
bowtie-build $ref hg38

生成的6个后缀为.bt2 的文件和fa文件在同一个目录下。
也可以指定保存目录~/software/bowtie2/bowtie2-2.2.3/bowtie2_index/

ref=~/refdata-gex-GRCh38-2020-A/fasta/genome.fa
bowtie-build $ref  ~/software/bowtie2/bowtie2-2.2.3/bowtie2_index/hg38

二、运行比对程序

1.双端测序

bowtie2 <-x 索引的位置和名称前缀> <-1 fq格式的测序结果文件1> <-2 fq格式的测序结果文件2> <-S 输出的sam文件>
-x 基因组索引文件前缀，不写路径表示当前路径下
-S 是输出sam文件的路径
-1和-2分别为双端测序的两个fq文件。-1（文件名通常包含_1）
-2（文件名通常包括_2）
比如：

index=~/software/bowtie2/bowtie2-2.2.3/bowtie2_index/hg38
bowtie2 -x $index -1 ~/data/example_1.fq -2 ~/data/example_2.fq -S ~/data/result.sam

就会得到sam文件了。

2.单端测序single end

bowtie2 -x ~/software/bowtie2/bowtie2-2.2.3/bowtie2_index/hg38 -U ~/data/example.fq -S ~/data/result.sam
-U为单端测序read文件

三、结果解读

1. 比对后结果显示：最后一行是比对率

image.png
image.png

双端结果里面分割线分成三部分。
part1:总共有多少对reads参加比对；合理比对aligned concordantly 的情况。合理比对意思是两端都比对上了，且合理。
如上图有650对reads没有合理比对上，其余的比对上1次或多次。
part2:650对中，有34对reads双端比对上了，但是不合理，可能是两条reads之间距离过大，或者两条reads居然在同一条链上。（合理的情况应该是两个reads在不同链上，且能距离很近。
part3:这些都是没有双端比对成功的。616对，就是1232条，这些里面有606条，

2. SAM （The Sequence Alignment / Map format）格式文件的解读

SAM是短序列比对默认的标准格式，是以TAB为分割符的文本格式。BAM就是SAM的二进制文件，具有更小的存储空间，并且许多下游分析工具使用的是BAM格式。

SAM文件
头部区：以’@'开始，体现了比对的一些总体信息。比如比对的SAM格式版本，比对的参考序列，比对使用的软件等。

主体区：比对结果，每一个比对结果是一行，有11个主列和一个可选列。
第一列：QNAME，比对的序列名称，就是fq文件中的read ID，是一条测序read的名称。
第二列：FLAG，比对上的情况
第三列：染色体名称
第四列：POS，比对上的最左面的定位
第五列：MAPQ，比对的质量值。越高说明比对的越唯一，最高60
第六列：CIGAR Extended CIGAR string，M表示匹配、I表示插入、D表示删除、N表示内含子和D类似、S表示替换、H表示剪切。87M表示87个碱基在比对时完全匹配。
第七列：MRNM，这条reads第二次比对的位置，是比对上的参考序列名 。=表示参考序列与reads一模一样，*表示没有完全一模一样的参考序列。
第八列：MPOS，与该reads对应的mate pair reads的比对位置（即mate），若无mate,则为0。
第九列：ISIZE 插入片段长度 例如：200。如果R1端的read和R2端的read能够mapping到同一条Reference序列上（即第三列RNAME相同），则该列的值表示第8列减去第4列加上第6列的值，
第十列：SEQ，和参考序列在同一个链上比对的序列，即read的序列。
第十一列：比对序列的质量（ASCII-33=Phred base quality）reads碱基质量值 例如：-8CCCGFCCCF7@E-

四、BAM文件

1. SAM 文件转为 BAM 文件

得到的sam文件可以用semtools专程bam文件。
samtools sort example.sam>example.bam

2. 通过管道命令直接链接samtools

bowtie2 -x genome_index -1 input_1.fq -2 input_2.fq | samtools view -bS | samtools sort > output.bam
这条命令把bowtie2 生成的sam文件通过管道|传递到samtools，将sam转换为bam文件，省去中间sam文件的空间占用