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研究概述：
端粒酶抑制渐进性端粒缩短是预防癌症的保护机制。端粒酶活性可以在癌症类型中高达90%的人类恶性肿瘤中检测到。其核心酶仅由催化成分端粒酶逆转录酶（TERT）和内部模板端粒酶RNA（TERC）组成。TERC几乎无处不在地进行表达，而TERT基因在大多数正常的人体躯体细胞中被严格抑制，这导致端粒酶在这些细胞中沉默。因此，转化细胞在癌基因发生中获得端粒酶活性需要对TERT基因进行转录抑制。在本研究中，作者全面分析了TERT、TERC和8个特征良好的端粒酶辅因子的多维改变、失调机制、与致癌事件的相关性以及来自TCGA数据集的33种癌症类型的生物/临床影响。
研究结果：
一、33种癌症类型中10种端粒酶成分的表达概况
1.除了核心端粒酶成分TERT和TERC外，本实验还对以下端粒酶附件因子进行分析：（1）DKC1、NHP2、NOP10、TCAB1和GAR1，它们与端粒酶核心TERT和TERC稳定相关，（2）桥素、雷普汀和NVL，复合体中的三个ATPa为端粒酶活性提供ATP（图1A）。
2.肿瘤中的TERT水平增长最强劲和广泛，这发生在除THCA以外的20种癌症类型中。在15种癌症类型中，发现了TERC表达的上调，而THCA出现显著减少。在大多数肿瘤中，8种端粒酶辅因子的水平更高，但程度要小得多。在具有显著TERT上调的癌症类型中，一般情况下其他端粒酶成分的水平也增加了（图1 B）。
二、基于端粒酶成分表达的泛癌分层
1.作者使用“端粒酶”评分“(TS)为整体水平的10个端粒酶组分，根据这10个组分的表达情况比较不同癌症类型样本中的基因。基于所有肿瘤标本中无监督的分层聚类，识别出三个不同的集群：集群A和B（TS-CA和TS-CB），分别具有TS或所有10个端粒酶基因的最低和最高表达，集群C（TS-CC）作为中间亚型，显示其表达水平在10个基因中不一致。（图1C）进一步的比较表明，端粒酶成分在TS-CB中最高（NVL除外），而在TS-CA亚型中最低（图1D）。
绝大多数KIRC、KICH、KIRP、THCA、PCPG、PADD和LGG，以及一半以上的PRAD和SARC属于TS-CA亚型，而TS-CB主要由DLBC、UVM、UCS、OV、THYM和UCEC组成；大多数STAD、GBM、HNSC、LUSC、ESCA、BRCA、LUAD和LAML都属于TS-CC子类型；BLAC、COAD、READ、TGCT、SKCM和CESC在TS-CB和TS-CC子类型之间几乎平均分布，而TS-CA和TS-CB集群中的ACC样本数量几乎相同（图1E）。
2.与TS-CB和TS-CC亚型患者相比，TS-CA患者的OS时间最长（P<0.0001）。TS-CB和TS-CC子类型对操作系统的影响是相似的。（图1F）
在33种癌症类型中，有10种癌症类型在较高的TS和更差的生存率之间存在显著关联，最后，确定了10个因素对OS的影响，并观察到DKC1、NVL和GAR1的更高表达分别与9、3和3种癌症类型显著相关，其余7个因素的较高水平与依赖肿瘤类型的OS呈正相关或负相关（图1G）。
三、TS与癌症类型的干性、增殖和EMT特征的相关性
1.作者评估了端粒酶活性与癌症干与TS的关系，观察到TSs和干性得分之间存在强烈的正相关，TS-CB亚型得分最高（图2A和B）。此外，除PCPG和LGG外，所有癌症类型都存在显著的相关性（图2C和图。S2）。用Ki67作为特定标记，并分析了它与TS的关系。Ki67 mRNA丰度与所有癌症类型的TS显著相关（R = 0.54，P < 2.2e−16）（图2D）。在每种癌症类型的大多数队列中，相关性仍然非常重要（图2E）。
2.进一步评估了TS和EMT分数之间的关系，发现泛癌的TS和EMT分数以积极的方式显著相关（图2F）。对于单个癌症类型的分析，TS在15种癌症中与EMT分数显著相关，而在14种癌症类型中没有显著相关性（图2G）。其中4个（KIRP、KICH、THCA和PRAD）观察到了反向相关性（图2G）。
四、基于TS的亚型的微分生物通路富集
1.作者进行了GSEA分析。通路和TS之间的稳健正相关包括MYC和E2F通路、G2M检查点和MTORC1信号通路，氧化磷酸化和糖酵解途径都与TS呈正相关（图3A，3B）。此外，在较高的TS组中，脂肪酸代谢和脂肪生成途径得到了丰富。在大多数癌症类型中，DNA修复和展开蛋白质反应随着TS的增加而强劲增加。另一方面，TS与炎症和免疫反应途径成反比，包括通过NF-kB、IL6-STAT3、IL2-STAT5、TGFβ和补体信号通路的TNFα。出乎意料的是，在23种癌症类型中观察到TS和EMT之间存在负相关（图3A，3B），与泛癌分析中观察到的正相关相反（图2G）。
五、推动TS亚型特异性活动的特色基因组变化
1.进行比较：（i）TMB；（ii）SCNA；（iii）非整倍体；（iv）LOH和（v）HRD。TS-CA亚型的TMB、SCNA、非整倍体、LOH和HRD水平最低，而TS-CB和TS-CC在所有这些更改中都明显更高。这些像差在很大程度上彼此相似或显著不同，但在TS-CB和TS-CC之间差异要小得多。（图3A）
2.作者关注了十种致癌途径特有的改变。在三个TS亚型中，十分之九的通路差异很大，而只有TGFβ通路大体相似。在这九种途径中，包括细胞周期、Hippo、MYC、Notch、NRF2、TP53、PI3K、RTK-RAS和WNT，在TS-CB和TS-CC中，在灭活肿瘤抑制剂功能的同时促进致癌活性的基因组改变比在TS-CA亚型中观察到的频率要频繁得多（图3D）。例如，在PI3K通路成员中，TS-CA、TS-CB和TS-CC亚型的致癌性PI3KCA的突变/放大频率分别为8.2%、33.4%和31.8%，而负PI3K调节剂PTEN的功能丧失事件分别为7.0%、22.4%和15.1%（图3C）。细胞周期通路的改变与PI3K成员的改变非常相似。在MYC通路中，TS-CB的MYC放大频率比TS-CA高出2倍多（图3C）。
六、亚型之间免疫细胞的功能差异
1.计算了肿瘤免疫功能障碍和排斥（TIDE）评分，TS-CB亚型的髓细胞源性抑制细胞（MDSC）和M2巨噬细胞（M2）得分最高，而癌症相关成纤维细胞（CAF）得分最低（图4A）。
2.根据肿瘤中位TS值，将接受治疗的患者分为高TS组和低TS组，低TS组患者的OS和PFS明显更长（图4B）。在这些队列中，剩余的130名患者接受了MTOR抑制剂Everolimus的治疗。进行与上述相同的分析，在Everolimus治疗的患者中，TS与OS或PFS无关（图4C）。
七、癌症类型端粒酶成分的复制数变化（CNA）和突变景观
1.在10个端粒酶成分中，TERC复制数量的增加最多，其放大占主导地位，而纯合子删除非常罕见（图5A和5B）。几乎一半的OV和LUSC以及>1/4的CESC和HNSC肿瘤都蕴藏着TERC扩增（图5A和5B）。第二种最常见的基因是TERT，其次是NVL、RUVBL1和DKC1。与TERC一样，TERT扩增是一种显性改变，但在3.3%的KICH和≥2%的CHOL、LAML、DLBC和SARC肿瘤中观察到其纯合子缺失（图5A和5B）。对于NVL2、RUVBL1和DKC1，放大频率>5%分别发生在8、7和5种癌症类型中。NHP2扩增主要出现在KIRC（23.1%）、ACC（7.9%）和OV（5.4%）。TCAB1的纯合子缺失是端粒酶贩运、组装和功能必不可少的因素，发生在11.7%的PRAD、6.9%的LIHC和6.6%的SARC肿瘤中（图5B）。对于所有10种端粒酶成分，基因扩增导致其表达水平最高（图S5）。
2.进一步分析了10种端粒酶成分的体细胞突变。总突变频率为4.5%（464/10245肿瘤），主要发生在TERT、NVL、RUVBL2、TCAB1、DKC1和RUVBL1中（图5C）。突变似乎是随机的，至少对于TERT和DKC1来说，在损害其功能的已知地点没有发生突变（图5D）。此外，这些基因的突变特征也表现出以下特征：（i）突变事件通常在10个基因中相互排斥，以及（ii）突变和扩增经常同时发生。另一方面，GAR1、NHP2和NOP10基因的突变很少见，也没有TERC突变的记录。
3.CNA和端粒酶成分的突变在UCEC中都很常见，而CNA在LUSC和PRAD中占主导地位，然而，LUSC和PRAD分别表现出广泛的放大和删除。（图5D，5F）
八、TCAB1基因纯合子缺失的肿瘤细胞中的端粒酶活性
1.在CCLE数据库中，40%的血癌衍生细胞系携带纯合子TCAB1缺失，这些细胞系中的TCAB1表达显著减少（图6A）。使用EXTEXT来估计这些细胞中的端粒酶活性，我们观察到有和没有TCAB1缺失的细胞系之间没有差异（图6A）。将样本分为杂合子、纯合子TCAB1基因缺失，没有缺失（其他），结果显示大多数癌症类型中三组的酶活性相当。在12种端粒酶活性显著差异的癌症类型中，在杂合子TCAB1缺失的组中最常观察到最高的EXP评分（图6B），TCAB1的纯合子和杂合子缺失导致基因表达显著降低（图6B）。
2.TCAB1-删除的细胞表达的TCAB1蛋白水平明显较低，但与没有TCAB1复制缺失的细胞相比，它们的端粒酶活性没有下降甚至更高。值得注意的是，HL60细胞表达的TCAB1可以忽略不计，但在所有6个细胞系中端粒酶活性水平最高，这些细胞系中的TCAB1蛋白水平与端粒酶活性之间没有相关性（图6C）。
九、端粒酶组分的DNA甲基化和m6A调控
1.对于TCAB1，除了TGCT、DLBC和THYM外，几乎所有癌症类型都观察到了负相关性。DKC1、RUVBL1表现出类似的相关性。在大多数癌症类型中，NHP2和TERC的表达与DNA甲基化呈负相关（图7A）。
2.TS与METTL3正相关，而在大多数癌症类型中与METTL14负相关。（图7B）另一方面，一种m6A去甲基化酶FTO，在大多数癌症类型中与TS呈负相关。此外，m6A募集的结合蛋白YTHDC 1、YTHDC2、YTHDF3和FMR1在大多数癌症类型中呈负相关，而HN NPC、HNRNPA2B1、YTHDF1和RBMX与TSs呈正相关（图7B）。
十、针对端粒酶成分的药物
在大多数癌症类型中，核糖体蛋白抑制剂也与TS成反比。溴蛋白酶抑制剂，特别是BRD4抑制剂，表现出最广泛的活性，这与之前的一项研究表明BRD4抑制对端粒酶活性具有强大的抑制作用是一致的（图8）
十一、具有替代端粒延长（ALT）激活或没有端粒维护的肿瘤中的TS
根据ATRX或DAXX基因突变、TERT阳性肿瘤和双阴性（TERT/ALT-）肿瘤对ALT肿瘤进行了分类。图9A显示了三种不同肿瘤的33种癌症类型的分布。TERT-/ALT-肿瘤的TS最低，而TERT+肿瘤最高，TERT-/ALT-和TERT+肿瘤或ALT+肿瘤之间的统计差异（图9B）。TERT+肿瘤的TS高于ALT+肿瘤，但差异在统计学上并不显著（图9B）。Sankey图进一步显示了这些肿瘤与TS亚型之间的关系：TS-CB和CC亚型主要来自TERT+肿瘤，TS-CA来自TERT+和TERT-/ALT-肿瘤，而ALT+肿瘤平均分布在3个TS亚型中（图9C）。
研究总结：在本研究中，作者直接分析了人类癌症的10种端粒酶成分，并根据它们的表达异质性确定了三种不同的亚型。端粒酶成分的差异表达可归因于其CNA和表观遗传畸变。关键发现之一是，缺乏TCAB1的癌细胞中存在高端粒酶活性。重要的是，三种不同的亚型与癌症干性、EMT、增殖、代谢重新编程、基因组不稳定、免疫逃逸和由各种致癌信号通路驱动的患者存活率不同。在癌症发生过程中，端粒维护是整个致癌程序的一部分，靶向上游事件可能有助于有效阻止癌症中端粒相关畸变。
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