空间基因表达对于理解细胞在组织中的身份和功能至关重要。现有的单细胞测序方法均会丢失细胞在体内的位置信息。而对于某些研究领域，如干细胞或者前体分化，神经研究和肿瘤生物学等，细胞来源的位置信息又至关重要。所以获得空间层面的单细胞测序数据一直是一个非常真实的需求。
Geo-seq 通过整合与优化单细胞测序和激光显微切割技术，获得少量细胞转录组信息的同时可以保留细胞原有位置信息，是一种高效高分辨率的空间测序新技术。而 10x Genomics 推出的 Visium 空间基因表达解决方案创造性的提供了另外一种思路：结合显微成像技术和 RNA 测序技术，使用常规的组织切片，无缝衔接现有的实验室设施和标准操作，获取切片上不同位置细胞中的完整转录组数据，为空间转录组研究带来了更多可能。
Visium Spatial：定量定位检测基因表达
组织样本的复杂性使得我们难以采用高通量的方式在分子水平上研究识别组织功能。免疫组织化学和 H&E 染色是基于蛋白质表达和细胞形态学研究组织结构的基础工具。结合了传统组织学技术和高通量 RNA 测序的双方面的优点的 Visium 空间基因表达解决方案可以对具有形态学背景的完整组织切片进行无偏倚、高通量的总 mRNA 分析，呈现前所未有的组织的生物学图像，而这一方法共同整合在 Visium 空间基因表达载玻片中。
载玻片：能提供的远不止组织学信息
通过采用 Poly A 捕获和新型的空间条形码技术来制备文库，可以使用载玻片绘制复杂组织样本的空间基因表达图谱。新鲜冷冻组织切片后放置在具有数千个条形码标记的点的载玻片上，每个点包含数百万用于捕获的寡核苷酸，并且每个点都有具有独特的空间条形码(图1)。组织切片固定，染色和透化后，就会释放 mRNA，mRNA 从组织的近端位置结合捕获寡核苷酸。组织在原位发生逆转录反应，生成包含空间条形码并保存空间信息的 cDNA 文库。条形码 cDNA 文库被映射定位到捕获区域的特定位置。该基因表达数据层随后叠加到组织切片的高分辨率显微镜图像上(图2)，在组织形态学上以空间分辨的方式可视化任一 mRNA 或 mRNA 组合的表达。
图1 Visium 空间基因表达的载玻片组成说明。每个载玻片包含四个捕获区，每个捕获区包含大约5000个条形码标记的捕获点，每个捕获点包含数百万个空间条形码捕获寡核苷酸。组织释放 mRNA，mRNA 与条形码寡核苷酸结合，从而捕获基因表达信息。
图2 小鼠冠状脑组织切片叠加空间基因表达信息。捕获点对应基因 Selenow 和 HPCA 的定位 mRNA，这两个基因在海马体中有显著表达。
无缝衔接现有实验室设施：轻松高效使用 Visium Spatial
Visium 空间基因表达解决方案可在现有的实验室基础设施中轻松开展，利用标准的实验室方法和工具进行组织分析。从头开始，在一天内完成你的空间基因表达文库构建，或在潜在停止点暂停，以后继续实验。
新鲜冷冻组织样本切片后放置在 Visium 空间基因表达载玻片的四个捕获区域中（工作流程中可以暂停，潜在停止点）。使用标准的固定和染色技术，包括苏木素和曙红(H&E)染色，组织切片在载玻片上通过显微镜可视化（潜在停止点）。组织透化后，细胞释放 mRNA。mRNA 与数据点上的带空间条形码的寡核苷酸结合。捕获的 mRNA 逆转录生成 cDNA。然后 cDNA 的第二条链合成并变性。注意，如果您的组织样本是第一次使用 Visium 空间基因表达解决方案，需要事先进行组织优化。条形码 cDNA 混合在一起用于下游应用，文库制备和 cDNA 扩增（潜在停止点）。随后片段化和处理 cDNA，建成测序就绪文库。最后一步是 PCR 添加样品 index（潜在停止点）。使用标准的短读测序仪对 Visium 空间基因表达文库进行测序，并使用 10x Genomics 软件 Space Ranger Analysis Pipeline 和 Loupe Browser 对数据进行分析和可视化。
图3 Visium 空间基因表达解决方案测序文库构建示意图
图4 Visium 空间基因表达解决方案的工作流程图
应用方案的亮点
• 将具有空间分辨率的全转录组分析与形态学背景相结合；
• 在多种样品类型中获得高通量基因表达谱；
• 通过绘制所有基因活动发生的位置，全面了解疾病的复杂性；
• 通过无偏分析发现新的目标；
• 无需裂解样品以进行基因表达研究。
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