Visium空间转录组测序检测组织切片中的总mRNA，并要求用于Visium空间玻片的样品为完整的组织切片。正确的组织处理和制备可以保持组织切片的形态质量和mRNA转录的完整性，这对于之后制备测序文库和生成高质量测序数据至关重要。
组织冷冻与包埋
新获得的组织样本必须快速冷冻，以防止RNA降解并避免可能导致组织的形态学损伤的晶体形成。样本冷冻后需立即使用OCT包埋，以保持组织结构，同时在冷冻切片过程中提供结构支撑。
01 组织冷冻
a) 用镊子或抹刀将组织放入异戊烷中，直到完全浸没。浸泡约1分钟或冷冻。
b) 组织冷冻结束后迅速转移到预冷的冻存管中，置于干冰上。
c) 将冷冻组织在-80℃长期保存，或立即进行冷冻组织包埋。
为防止组织样品蒸发和脱水，快速冷冻的组织样品必须储存在密封容器中。
图1 异戊烷和液氮浴冷冻组织（图片引自《10x Genomics: Visium Spatial Protocols – Tissue Preparation Guide》）02
冷冻组织包埋
a) 标记一个合适大小的包埋模具以便记录组织放置的方向（可拍照记录），将模具放于碎干冰上。
在加入OCT和组织之前，对包埋模具做标记。一旦冷冻，OCT很快就会变白，这使得以后很难确定组织的方向。
b) 在包埋模具中注入冷冻OCT，避免产生气泡。
c) 使用预冷镊子，将冷冻组织放入OCT中。用额外的OCT覆盖任何暴露表面
确认组织周围没有气泡。
d) 立即将含有组织和OCT的冷冻模放在粉状干冰上，直至OCT完全冻结。
e) 将OCT包埋的组织块在-80℃的密封容器中长期保存，或立即进行冷冻切片和切片放置。
不使用密封容器储存可能会使组织脱水并受损。
图2 OCT包埋冷冻组织（图片引自《10x Genomics: Visium Spatial Protocols – Tissue Preparation Guide》）
冷冻切片和贴片
OCT包埋的组织块在冷冻切片机上进行冷冻切片，以便在保持样品冷冻的同时获得Visium空间玻片适当大小的切片。
01 冷冻组织切片
组织块前处理（埋入样品盘）
a) 用OCT试剂填充样品盘。
b) 将OCT包埋的组织块置于样品盘上，切面朝外（建议将面积较小的组织部位朝外）。
c) 将带有组织的样品盘放置在冷冻切片机上。
d) 让OCT和组织块冻结并粘附在样品盘上。
图3 OCT包埋组织块安置到样品盘（图片引自《10x Genomics: Visium Spatial Protocols – Tissue Preparation Guide》）
去除多余的OCT：
a) 将带有组织块的样品台安装在冷冻切片机的样本头上，并开始切片以去除多余的OCT。
b) 持续切片直到组织可见为止。
组织刻痕切分：
在切片过程中，可以对大的组织样本进行刻痕切分，以生成更小的样本，以适应捕获区域。刻痕切分时，用预先冷却的刀片在组织的切割面上做一个浅切口（约1mm）。
切口太深可能导致组织损伤和解体。
图4 组织刻痕切分（图片引自《10x Genomics: Visium Spatial Protocols – Tissue Preparation Guide》）
表1 切片厚度推荐
02 切片放置
图5 样品头温度对切片质量的影响（图片引自《10x Genomics: Visium Spatial Protocols – Tissue Preparation Guide》）
a) 获得所需的组织切片后，用低温恒温刷小心地将组织切片展平。
b) Visium玻片（事先在冷冻切片机中平衡30min以上）的捕获区域倒扣贴到组织片上。
玻片应与低温恒温器室保持平衡，避免玻片的活性表面与低温恒温器接触，因为它会损坏寡核苷酸并降低Visium空间玻片的捕获效率。
c) 将手指迅速放置于Visium玻片的背面，使切片完全粘附在Visium玻片上。
在整个切片放置过程中玻片应一直在低温恒温器室内。
d) 立即将带组织切片的Visium玻片置于冰冻器上冷冻。继续转移剩余捕获区域的组织切片。
图6 切片在Visium玻片上正确放置（图片引自《10x Genomics: Visium Spatial Protocols – Tissue Preparation Guide》）
对于Visium空间组织优化玻片，将切片放置在8个捕获区域中的7个，另一个用于进行阳性对照。
图7 切片在Visium组织优化玻片上的放置（图片引自《10x Genomics: Visium Spatial Protocols – Tissue Preparation Guide》）
e) 将含有组织切片的Visium玻片转移到放置于干冰中的玻片
邮寄器中用于寄送，或直接进行下一步实验。
制备好的组织切片可于-80℃保存一周，每张玻片单独保存在一个密封容器中。
图8 保存条件对组织切片的影响（图片引自《10x Genomics: Visium Spatial Protocols – Tissue Preparation Guide》）
03 剩余组织快保存
a) 从冷冻切片机的样品头上取下与样品台相连的剩余组织块，放在低温台上。
b) 用OCT覆盖暴露的组织，使其冷冻。
c) 将组织块和样品盘从冷冻头上提起，用手轻轻加热样品盘，以将冷冻组织块与样品盘分离。
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