（1） 组装：GetOrganelle
例：get_organelle_from_reads.py -1 forward.fq -2 reverse.fq -o plastome_output -R 15 -t 16 -k 21,45,65,85,105 -F embplant_pt # Manual建议的均衡参数设置。-R：提取叶绿体基因 reads 的轮次（轮次越多，耗时越长）；-t：线程 -k：K-mer；-F：组装叶绿体
附：get_organelle_from_reads.py -1 forward.fq -2 reverse.fq -o nr_output -R 10 -t 16 -k 35,85,115 -F embplant_nr # Manual建议的nrITS组装参数
（2） 软件注释：PGA
例：PGA.pl -r reference -t target
# -r参考基因组，开发者推荐无油樟Amborella trichopoda，参考可放多个，引多个目录即可（-r, -t 地址均引用到文件夹，而不是文件本身）；-t拟注释的组装文件
GetOrganelle获得的是.fasta文件，可用Geneious实现格式转换。
我以Castanopsis一种为测试对象，使用Amborella trichopoda与NCBI Reseq C. hystrix分别为参考注释目标物种。结果以无油樟为参考注释得更多基因。无油樟是被子植物最基部类群（APGⅣ），属于最早完成注释的被子植物叶绿体基因组之一，可能较后来不知以何方法、参考注释的部分叶绿体更具参考价值。基于这一尝试，作者建议我先用Amborella trichopoda注释得我所需要的一个物种的叶绿体，然后使用Amborella trichopoda与该首次被注释的物种这两个基因组做参考注释更多近缘物种。
几个使用过程中出现的问题：
(1) 参考基因组可放多个，一起放在-r指定的文件夹中即可；待注释的组装文件也可在-t文件夹下放多个，软件将自动注释所有文件。
(2) 放置多个参考所得注释结果的 warn 数目可能不等同于单个参考分别注释的 warn 之和，因为不同参考间不一致的部分软件会提醒我们重新审核。
(3) 遇到如下错误：Command line argument error: Argument "query". File is not accessible: '/home/projectpath/plastome/test/test_ref//%W6RcFEu-IZgZ%_reference1'。我通过修改环境变量$PATH的位置得以解决，即：
export PATH=$PATH:/home/csp/lyz/software/PGA #错误写法
export PATH=/home/csp/lyz/software/PGA:$PATH #正确写法
sp. Amborella trichopoda参考基因组位置：xxx/PGA/test/angiosperms/reference。
（3） 完善注释：Geneious
（4） ……（待续）
参考文献：
[1] GetOrganelle-Toturial: https://github.com/Kinggerm/GetOrganelle
[2] PGA-Toturial: https://github.com/quxiaojian/PGA
[3] 叶绿体基因组注释软件PGA使用说明（开发者）：https://www.jianshu.com/p/6ac8a9fad9c9?native.theme=1
网友评论