文献链接：Spatial epigenome–transcriptome co-profiling of mammalian tissues
发表期刊：Nature
影响因子：49.962
发表时间：2023年3月新兴的空间组学技术（包括空间转录组学和空间表观基因组学），正在成为分析组织中细胞状态的有力工具。不过目前的技术手段都仅仅从单个组学的维度来解决问题，在这里作者将两种技术结合在一起实现空间水平上同一组织切片上的染色质可及性和基因表达分析。实验材料：小鼠胚胎（E13）、幼年小鼠脑、成人大脑海马体，用来绘制表观遗传机制如何控制组织中的转录表达特性和细胞动力学研究。
0. 技术流程和数据质控
0.1 实验原理与操作步骤
- step1：冷冻的组织切片用甲醛固定后，使用偶联DNA linker序列的Tn5转位复合物处理（DNA linker序列为一段已知碱基的序列，用于后续PCR扩增），该复合物会将linker序列插入到开放的染色质区域
- step2：组织切片与含有生物素标记的DNA序列（ 包含universal ligation linker和poly T序列）孵育，目的是与mRNA的polyA尾巴结合并完成逆转录携带universal ligation linker
- step3：将组织切片放置于微流控通道阵列芯片，引入空间条形码Ai (i = 1−50 or 100)
-
step4：使用另一个垂直于第一个流动方向的通道芯片引入空间条形码Bj（j=1−50 or./ll100）
Ai 和 Bj 为表观遗传组和转录组的空间条形码，最终逆转录获得的大片段cDNA（来源于转录组）通过链霉亲和素磁珠富集，gDNA（来源于表观遗传组）直接通过富集上清完成。两类DNA序列最终构建NGS文库用于测序。
0.2 实验设计
| 样本类型 | pixel size | total pixel number | 切片面积 | 实验类型 |
|---|---|---|---|---|
| 第13天小鼠胚胎（E13） | 50um | 2500 | 2.5mm x 2.5 mm | RNA, ATAC |
| 小鼠出生后第21/22天大脑（P21/22） | 20um | 10000 | 2mm x 2mm | RNA, ATAC, Cut&Tag (H3K27me3, H3K27ac, H3K4me3) |
| 成人大脑海马体 | 50um | 2500 | 2.5mm x 2.5 mm | RNA, ATAC |
0.3 数据质控
使用 2mm x 2mm（pixel size 20um; total number 10000）可以刚好覆盖P22小鼠脑冠状面的整个半球：
- ATAC 数据：每个pixel的中位 unique fragments 为14284（其中19%富集于转录起始位点，26%位于峰值）如图1b
- Cut&Tag 数据：每个pixel的unique fragments中位值10644（H3K27me3）、10002（H3K27ac）和2507（H3K4me3），其中12%（H3K27me3）、17%（H3K27ac）和67%（H3K4me3）与转录起始位点重叠，12%(H3K21%（H3K27ac）和54%（H3K4me3）分别位于峰值如图1b
-
RNA 数据：总计22914 genes检出，平均每个pixel 的gene检出1073，UMI检出2358 如图1c
在RNA数据中，共检测到25881个（H3K27me3）、23415个（H3K27ac）和22731个（H3K4me3）基因，平均每像素2011个（H3K27me3）、1513个（H3K27ac）和133K4me3)基因（4734个（H3K27me3）、3580个（H3K27ac）和2885个（H3K4me3）UMIs（图1c））。
图1. E13小鼠胚胎空间表观基因组-转录组共测序的设计与评价：图a. 工作流程示意图；图b. 比较空间ATAC-RNA-seq和空间CUT&Tag-RNA-seq中 unique 片段数和峰中reads（FRiP）的比例; 图c. 空间ATAC-RNA-seq和空间CUT&Tag-RNA-seq中的基因和UMI计数分布; 图d. ATAC、RNA、ATAC&RNA数据的空间分布和UMAP分群图; 图e. 空间ATAC-RNA-seq中ATAC和RNA不同簇中选定标记基因的GAS和基因表达的空间定位; 图f. 空间水平拟时序分析：径向胶质细胞-->有丝分裂后早衰神经元；图g. 描述基因表达和标记基因的GAS的热图; 图h. RNA表达和GAS沿着拟时序的动态变化
1. 小鼠胚胎的空间多组学共分析
E13小鼠胚胎 Spatial ATAC-RNA-seq共鉴定了8个主要的ATAC cluster和14个RNA cluster，表明在该发育阶段，单独做染色质可及性的分析不能进行准确的细胞类型区分。
ATAC数据分析：图1d左 & 图1e上
- A3代表胚胎的眼部，表现为Six6 基因位点上的染色质可及性
- A4-A5簇与几个发育中的内部器官有关
- A6-A7簇覆盖中枢神经系统（CNS）
RNA数据分析：图1d中
- R10（Six6）与胚胎眼相关
- R2、R6和R8与中枢神经系统相关
- R7与软骨的形成有关
（1）ATAC-RNA数据整合细化空间格局： 如图1d右，在联合据类分析中发现了一个新的神经元簇（J10），它不能通过单一的ATAC或RNA的数据分析来获得，这一结果强调了使用联合多组学来改进空间细胞类型映射的价值。
（2）ATAC-RNA数据整合有助于研究组织环境中染色质可及性峰与基因表达间的相关性：例如，一些marker基因（Pax6、Sox2和Myt1l）在胚胎脑的某些区域表现为高度可及性，但是其对应mRNA表达却相对较低。
（3）空间ATAC-RNA数据整合，可以用于解读组织发育过程中的基因调控机制和时空动态：为了研究胚胎发育过程中染色质可及性与基因表达之间的时空关系，作者分析了从径向胶质细胞向有丝分裂后早衰神经元等不同类型神经元的分化轨迹。将ATAC数据进行空间水平的拟时序分析，发育轨迹在空间组织中可以直接可视化（图1f）。染色质可及性GAS和沿着该发育轨迹的基因表达热图显示了marker基因的动态变化。与预期一样，Sox2、Pax6和其他参与祖细胞维持和增殖的基因在向有丝分裂后的神经元过渡的过程中表达水平下调。Pax6和径向胶质标记物Fabp7位点染色质可及性的缺失导致于相应mRNA表达的下调（图1h）。
2. 小鼠大脑的空间ATAC-RNA-seq
如图2a，作者开发了一个具有100个蛇形微通道的芯片（实现一张芯片做5个样本的目的），这里将组织切片分割为100 x 100条形码标记的区域（即，将组织切片分割为10000个小区域），像素大小20um。
P22小鼠大脑冠状面切片，通过该芯片用于染色质可及性与转录组的联合分析。不同于前面E13小鼠胚胎脑的分析，这里在ATAC数据中发现了14个cluster，mRNA分析11个cluster。幼年小鼠大脑中终端分化的大多数主要细胞类型相对于胚胎而言包括了很多未分化或多能的细胞状态（如2b）。
- ATAC 数据分析：通过marker基因可以确定组织区域（图2c,图2e上）
- RNA 数据分析：通过marker基因可以确定组织区域（图2d,图2e下）
整合分析发现：ATAC与RNA所决定的空间细胞类型分布具有高度的一致性，这表明染色质可及性和转录组在定义组织细胞身份方面存在普遍的一致性（图2c-d），例如神经元中间祖细胞、成熟的少突胶质细胞、新形成的少突胶质细胞和中棘神经元（MSN）在ATAC数据确定的相同区域富集。
与小鼠胚胎脑中观察一致的是，一些具有开放染色质可及性的标记基因（Sox10、Sox2、Neurod6、Pax6和Notch1）要么不表达，要么低表达（图2e）。这些基因中有许多参与编码神经发育的转录因子，表明这些基因在大脑发育过程中可能存在表观遗传记忆，而不是转录记忆。
图2. P22小鼠大脑的空间染色质可及性和转录组共谱分析；图a. 100×100, 20µm通道条形码微流控芯片设计；图b. 小鼠大脑空间ATAC-RNA-seq中ATAC和RNA的所有cluster的空间分布和UMAP图：像素尺寸(20µm),比例尺(1毫米)；图c. 整合小鼠大脑的空间ATAC数据和scATAC-seq数据（作者之前文章发表）；图d. 整合来自小鼠大脑的空间RNA数据和scRNA-seq数据（作者之前文章发表）；图e. 空间ATAC-RNA-seq中ATAC和RNA不同cluster中选定标记基因的GAS和基因表达的空间定位
3. 小鼠脑的空间CUT&Tag-RNA-seq
除了染色质可及性外，组蛋白修饰也是表观遗传调控的一个关键方面。作者采用空间CUT&Tag-RNA-seq分别对P22小鼠大脑的转录组和H3K27me3（抑制位点）、H3K27me3（激活启动子和/或激活子）或H3K4me3（激活启动子）组蛋白修饰进行共谱分析（20µm像素大小，100×100）。
CUT&Tag-RNA-seq共分析更清晰得鉴定细胞状态：通过H3K27me3和RNA数据分别鉴定了11和12个cluster。同时，CUT&Tag与RNA在空间格局上具有良好的一致性（图3a-c）。整合空间CUT&Tag和scCUT&Tag数据（图3d、e）表明，H3K27me3、H3K27ac和H3K4me3数据的表观遗传状态与scCUT&Tag对应的投影一致。表观基因组模式中的几个簇（簇C0、C1和C3）、scRNA-seq数据与来自同一组织切片的配对RNA数据的marker清楚地显示了这些cluster中的细胞身份（图3a、d），突出了在同一组织切片中结合CUT&Tag和RNA-seq（空间CUT&Tag-RNA-seq）的分析，可以更准确地识别细胞类型或状态。
图3. P22小鼠大脑的空间组蛋白修饰和转录组共分析; 图a-c. H3K27me3和RNA的所有聚类的空间分布和UMAP; 图d. 整合H3K27me3数据与来自小鼠大脑的scCUT&Tag（H3K27me3）数据（作者之前文章发表）; 图e. 将H3K27ac数据与来自小鼠大脑的scCUT&Tag（H3K27ac）数据进行整合（作者之前文章发表）; 图f. 将空间CUT&TAg（H3K27me3）-RNA-seq、空间CUT&TAg（H3KA27ac）-RNA-seq和空间CUT&TAg（H3K4me3）-RNA数据整合到小鼠大脑的scRNA-seq数据（作者之前文章发表）
4. 区域特异性基因表达调控
为了进一步了解基因组尺度上基因表达的空间表观遗传调控，作者比较了ATAC和CUT&Tag（H3K27me3、H3K27ac、H3K4me3）获得的GAS 或 CSS与P22小鼠大脑所有主要组织区域相应的RNA表达（图4a-c），包括胼胝体、纹状体和浅层、更深的皮质层，图4主要展示具有代表性的胼胝体。
（1）H3K27me3和RNA的逆向相关性：在少突胶质细胞丰富的胼胝体中，我们观察到H3K27me3和RNA之间存在强大的抗作用相关性（图4a）。低CSS和高RNA表达的Mal、Mag和Car2等基因对应髓鞘形成与少突胶质细胞分化的调控；相比之下，高CSS和低RNA表达的基因如Grin2b和Syt1与突触传递和神经递质释放等神经元过程有关；同时还有一个小的基因集在胼胝体中具有 H3K27me3和RNA的共同高表达，如Ptprz1，这是一种少突胶质细胞前体细胞的标记物，这也可能部分是由于胼胝体中少突胶质细胞前体细胞（表达Ptprz1）和成熟的少突胶质细胞（Ptprz1被抑制）的邻近存在。尽管RNA表达和H3K27me3沉积之间存在普遍的抗性作用，但是也可以在图4d中观察到区域差异。
（2）“H3K4me3或H3K27ac”和RNA的逆向相关性：与H3K27me3相比，我们观察到RNA与胼胝体中激活标记H3K4me3或H3K27ac之间的强大相关性，基因在少突胶质细胞中以这两种方式高表达和高沉积（图4b、c)。
（3）胼胝体中不同组蛋白修饰之间的集体调控：H3K4me3和H3K27ac普遍呈高度相关，其信号与H3K27me3不相关（图4e）。我们还观察到H3K4me3或H3K27ac和H3K27me3在该组织区域的几个基因位点上共同占据(图4e)。这些基因参与了少突胶质细胞的分化和髓鞘化，以及其他过程，如蛋白质的分解代谢和定位。其中一些基因，如Ptprz1和Fnbp1，也表现出较高水平的H3K27me3和RNA表达（图4a）。如上所述，这种潜在的H3K4me3/H3K27me3二价性可能反映了转录平衡。
图4.区域特异性表观遗传调控和基因表达；图a-c. H3K27me3 CSS与RNA基因表达的相关性；图d.H3K27me3 CSS和RNA在不同区域的表达相关性：+表示CSS或RNA高表达，-表示CSS或RNA低表达；图e. 维恩图显示具有常见RNA标记基因的胼胝体中不同组蛋白修饰的高（+）或低（-）CSS/GAS
5. 人脑海马体的空间映射
作者对成人（31岁男性）大脑海马体进行了空间ATAC-RNA-seq（这是一个复杂的大脑区域，涉及认知功能和重度抑郁症、阿尔兹海默症等相关疾病）。ATAC 数据分为7个亚群，RNA数据分为8个亚群，其空间格局与解剖标志物（图5a）一致。
（1）ATAC数据分析：A4对应颗粒细胞层（GCL）：THY1，BCL11B；A6对应于脉络丛（图5a，d）
（2）RNA数据分析：作者检测到了具有独特标记基因的不同簇（图5a，d），如在簇R4（GCL）中富集的PROX1和BCL11B。
（3）整合ATAC数据和来自人脑样本的scATAC-seq数据：RNA数据与成人大脑snRNA-seq数据对比，并将空间数据映射到对应的单细胞测序分群中（图5b）。可以看到颗粒细胞（GC）仅在GCL中检出，氨角神经元（CA）在CA3-4富集，脉络丛中的血管软脑膜细胞（VLMC）与其他区域显著不同。
（4）多组学分析的优势：一般来说，ATAC和RNA的数据都可以做到该区域的细胞分群，但是单一的ATAC和转录组恐怕无法提供动态基因调控机制的新见解（多组学共分析可以做到）。例如，POX1（锥体神经元的 marker gene）在颗粒细胞层（GCL）显著高表达，但是染色质可及性为中等。这可能是由于在有丝分裂后成熟的颗粒细胞中，对合成新的PROX1转录本的需求最小，因此不需要维持一个活跃的开放染色质状态。
图5. 人类海马体的空间染色质可及性和转录组共图谱分析；图a. 人海马体组织的明场成像，基于ATAC和RNA的所有cluster的空间分布和UMAP分群图：ML，分子层；Pyr，锥体神经元。像素尺寸(50µm)，比例尺(1 mm)；图b. ATAC数据与来自人类海马的scATAC-seq数据进行整合；图c. RNA数据与来自人类大脑的snRNA-seq数据进行整合；图d. ATAC和RNA不同簇中选定标记基因的GAS和基因表达的空间定位
Post script：证明了ATAC或CUT&Tag可以与RNA一起用于空间多组学定位。有可能结合所有三个染色质可及性、组蛋白修饰和转录组来描绘一个更全面的组织基因调控网络的景观。本文所报道的空间多组学可能会在神经科学 和 发育生物学之外得到广泛的应用。人类疾病组织空间映射的多种模式不仅相互交叉验证，而且更好地阐明了驱动异常细胞状态的机制，而单模式方法难以识别。空间信息可能进一步显示局部组织环境如何影响细胞状态、动态和功能。
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