Bottom-up实验流程

蛋白质提取
还原烷基化、酶解
分离、富集、除盐

蛋白酶解

蛋白酶解的作用
将长的蛋白质酶解成合适长度的多肽(7-13)便于质谱检测
常用的蛋白酶
1.Trypsin
特异的切断C端为Arg, Lys的肽键（若Arg, Lys后紧跟Proline, 酶切效率降低）
生成的肽段平均长度为9个氨基酸
胰酶酶解生成的肽段至少为2+价，易于离子化
2.Lys-C
3.Arg-C
4.GluC

蛋白质酶解后的串联质谱检测

经过多年的探索，科学家发现多肽在被ESI 源轰击后，会带上正电，而且一般是带2-6 个电荷，几乎不可能只带一个电荷。因此，基于串联质谱正电荷模式的检测是鉴定多肽的好方法。

串联质谱

带正电的多肽作为质量分析器选择之前的前体离子(Precursor Ion), 经过高能裂解后产生产物离子(Product Ion) 以及中性碎片(Neutral Fragment), 这些离子群传至第二个质量分析器（或者是同一个质量分析器再次分析）鉴定其m/z的值。

串联质谱中离子活化的方式

肽段的碎裂需要能量，虽然有各种不同的离子活化(Ion Activation) 方式，但是基本原理都是增加其内能来断裂不同的化学键。最常用的两种离子活化方法是HCD(高能碰撞诱导解离，Higher energy Collision induced Dissociation) 和ETD(电子转移解离，Electron Transfer Dissociation)，也有一些高端仪器同时支持这两种解离方法，称为EThcD。

串联质谱中不同的离子活化方式1

串联质谱中不同的离子活化方式2

串联质谱中不同的离子活化方式3

对于不同的离子活化方式，同一条多肽的碎裂情况是不一样的。HCD 会产生b，y 离子，ETD 会产生b,y,c,z 离子。对于翻译后的糖基化修饰，HCD 会“打碎” 产生糖的碎片，而ETD 则完整的保留了糖基化修饰。多肽的碎裂情况不仅跟离子的活化方式有关，与多肽本身的理化性质，活化能的设定值都有关系。

串联质谱对扫描分析模式

蛋白质组学中，常用的扫描模式有4 种：
1.产物（碎片）离子扫描（Product Ion Scan)
2.前体离子扫描(Precursor Ion Scan)
3.中性丢失扫描(Neutral Loss Scan)
4.选择反应监测(Selected Reaction Monitoring, SRM)

产物离子扫描是最常用的模式，质谱仪会根据仪器性能，自动选择丰度最高的10-20 个前体离子(Precursor Ion)，碎裂后再进行二级质谱检测，这样能发挥仪器的最大性能，检测尽可能多的谱图用于后续鉴定。

前体离子扫描模式可以设置二级质谱的特征分子量。例如N-糖的二级特征分子量是204.086，当二级质谱检测到204.086 的信号时，一级质谱会尽可能多的检测含有该特征分子量的前体离子。

中性丢失扫描模式与前体离子扫描模式类似。由于部分碎片是电中性，质谱不能检测到。所以可以设置质量差值a, 例如一级质谱检测到的分子量为m, 如果二级质谱检测到的分子量为m-a，则会报告发生中性丢失，用于后续分析。

选择反应监测模式专门检测指定质荷比的离子，需要提前通过计算或者实验得到目标多肽的质荷比，再进行检测。由于只检测特定信号，信噪比很高，提升了定量分析的灵敏度。

不同的扫模式