来源：https://www.bilibili.com/read/cv15619704/
写在前面：
质粒由于其易操作的特点被广泛用做标准品，进行样品的定量。
但实验过程中，我们会遇到质粒的检测拷贝数与理论拷贝数不符合的情况，就猜测质粒的结构，DNA浓度的测定，质粒的保存方式都可能对qPCR的结果产生影响。
质粒DNA分子的四种构型：
1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；
图片来源于网络，侵删
2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA，即OC构型；
3．两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，但是没有形成超螺旋构象，这样的DNA通常称之为闭合环状DNA；
4．若质粒DNA经过适当的限制性核酸内切酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型。
三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋> 线形> 开环
质粒构象对qPCR结果的影响
有文献研究结果表明[文献1]：
1、闭合环状质粒DNA和超螺旋质粒DNA的qPCR标准曲线没有显著差异；
2、线性质粒DNA和开环质粒DNA在qPCR校准曲线的线性范围内，Ct值较超螺旋质粒DNA低（ 模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在一定线性关系，起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大）；
线性质粒DNA
开环质粒DNA
闭合环状质粒DNA
3、质粒DNA构象对qPCR扩增效率无显著影响（P>0.05）。
Supercoiled (S)，Linear (L), close circular (C) and nicked-circular (N) form plasmids.
4、相对扩增通过与对应的超螺旋质粒组的△Ct 值进行计算，在4种qPCR反应中，开环状质粒DNA的PCR扩增率最高，大约是超螺旋质粒DNA的4.5倍；线形质粒DNA的相对扩增倍数约为超螺旋质粒的2.3~3.2倍。
Taqman探针两端分别带有荧光基团和荧光淬灭基团，在正常状态下，探针上的荧光被淬灭，不发出荧光。PCR扩增后，探针被PCR酶水解，淬灭基团与荧光基团分离，释放荧光信号；根据荧光信号得出DNA扩增的量。
Taq-MGB：在之前探针的基础上，连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可将探针的Tm值提高10°C左右，该探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，降低了合成成本，提高了成功率（模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计；且TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板区分得更理想）；且淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。
LNA是一种新型核酸类似物，含有2'-O，4'-C亚甲基桥。这种桥接锁定在3'-内构象中，限制了呋喃核糖环的灵活性，并将结构锁定为刚性双环形式，使LNA 与互补的模板杂交时具有更强的热稳定性，适用于高特异性和高亲和力探针的技术(如 SNP 检测、表达谱分析和原位杂交)。
图片来源网络，侵删
有文献研究结果表明[文献2]：
1、qPCR检测到与未经处理的超螺旋DNA相比，线状和开环DNA的扩增几乎增加了6倍，而闭合环状DNA的扩增仅增加了2倍。
pBR322质粒
质粒结构与DNA定量方法之间的差异
主要有3种：紫外吸光光度法，荧光染料结合法和数字PCR。
紫外吸光度（OD260）：是一种低成本、中等灵敏的定量DNA的方法
原理：组成核酸分子的碱基具有苯环结构，在紫外区260nm处具有最大吸收波长，通过测定260 nm的吸收峰即可对DNA进行定量；核酸样品中最常有的其它吸光物质为蛋白质，其在280 nm处具有最大吸收峰，因此测定A260/A280比率，可以判断核酸的纯度。
荧光染料结合法：是一种高灵敏度和特异性的定量核酸的方法。
原理如下图所示：
图片来源于网络，侵删
Hoechst荧光染料：是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，它在嵌入双链 DNA的A-T区后，形成膜渗透性荧光DNA链，释放强烈的蓝色荧光，对细胞的毒性较低；常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测，也可用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。
数字PCR：将一个样本分成几十到几万份，然后再将其分配到不同的反应单元中，使每个微滴单元包含一个或多个拷贝的核酸分子（即DNA模板），每个单元都会对目标分子进行扩增，然后再对每个单元进行荧光信号的统计并计算。不依赖于扩增曲线循环Ct值，不受扩增效率的影响，能够直接读出DNA的分子个数，能够对起始样本核酸分子绝对定量。
原理如下：
图片来源于网络，侵删
有文献研究结果表明[文献1]
1、用于定量超螺旋质粒DNA的方法之间有很大的差异，其中最大的差异发生在UV吸光度和HPLC方法之间（图A），约为2.5倍。
图A
2、质粒 DNA 构象，缓冲液成分都不会对 Hoechst 33258 方法的 DNA 定量产生显著影响。
图B
3、紫外吸光度法检测的结果中，线形质粒DNA的浓度显著升高。
图D
有文献研究结果表明[文献3]
1、分光光度计检测质粒浓度后，稀释四种线性质粒标准品（Camp jej、Camp lar、AdV fib
和 SA442）后，使用 ddPCR进行绝对定量，发现ddPCR检测结果是紫外分光光度检测法的57%、91%、90% 和 71% 的理论量，且不同批次存在差异。
质粒DNA的保存
有文献研究结果表明[文献4]
1、不同保存条件对质粒DNA稳定性的影响，-80℃条件下，不同质粒构象结构稳定（A）；4℃条件下，4个月之后质粒结构构象开始发生变化，不适用于长期保存。
-80℃
4℃
参考文献：
1、Lin CH, Chen YC, Pan TM. Quantification bias caused by plasmid DNA conformation in quantitative real-time PCR assay.
2、Chen J, Kadlubar FF, Chen JZ. DNA supercoiling suppresses real-time PCR: a new approach to the quantification of mitochondrial DNA damage and repair.
3、Beinhauerova M, Babak V, Bertasi B, Boniotti MB, Kralik P. Utilization of Digital PCR in Quantity Verification of Plasmid Standards Used in Quantitative PCR. Front Mol Biosci.
4、Walther W, Stein U, Voss C, Schmidt T, Schleef M, Schlag PM. Stability analysis for long-term storage of naked DNA: impact on nonviral in vivo gene transfer.
作者：西分测小师妹 https://www.bilibili.com/read/cv15619704/ 出处：bilibili
网友评论