m6A RNA甲基化是最常见、最丰富的真核生物mRNA转录后修饰。研究表明，m6A 在不同组织，细胞系中是一个复杂的调控网路，m6A RNA 甲基化参与 RNA 的代谢过程，并与肿瘤的发生和发展密切相关。本期着重解读两篇癌症中的 m6A 研究，看一下 m6A RNA 甲基化如何玩转高分期刊。
文献一
2020年10月，南京医科大学汪秀星课题组和美国 UCSD Jeremy Rich 等课题组在Cancer Discovery上发表题为“The RNA m6A readerYTHDF2 maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells”的研究论文。该研究为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。
研究背景
胶质母细胞瘤（GBM）代表了最常见的原发性，内在性脑肿瘤，患者的平均生存期限制在一年以上。鉴于胶质母细胞瘤干细胞（GSC）在治疗抗性，血管生成，免疫逃逸和侵袭中的作用，临床和临床前观察表明，靶向GSC可以改善肿瘤预后神经肿瘤学上的精准医学研究。
研究方法
研究结果
1. 在 GSC 中上调的致癌转录本以 RNA m6A 修饰为标志
作者利用 MeRIP-seq 对 GSC 和神经干细胞（NSC）进行 m6A 标记的检测，结果发现，与非肿瘤对应物相比，GSCs 的m6A 分布发生了改变。通过38个 GSCs 和5个 NSCs 的队列中的 RNA-seq 数据进行 GSEA 分析，具有 m6A 峰的基因在GSC 高度富集，而且在 GSC 中获得的具有 m6A 峰的基因均被上调。相反，相对于 NSC、GSC 中丢失 m6A 峰的基因通常在 GSC 中被下调。而且，在 GSC 中，与癌症干细胞相关的重要基因上获得了 m6A 峰，包括表达增加的OLIG2 和MYC。
图1 GSC中的 m6A修饰
2. YTHDF2 在 GSC 中表达上调，对 GSC 的维持至关重要
作者为研究 m6AYTHDF 在胶质母细胞瘤中的功能作用，利用 CRIPR 技术检测了YTHDF2，相对于对照 sgRNA，敲除YTHDF2 会降低细胞活力及减少 GSCs 中细胞球形成。为研究了YTHDF2 耗竭是否会诱导 GSC 分化，正交实验发现，shRNA 介导的YTHDF2 敲低会降低 GSC 的活性，过表达的YTHDF2 可以挽救 GSC 的活性。结果表明，YTHDF2 是胶质母细胞瘤维持的一个特异性和有效的调节因子。
图2 YTHFD2对GSC的维持
3. YTHDF2 通过 m6A RNA 修饰支持 GSCs 中的基因表达
作者利用 RNA-seq 检测YTHDF2 的下游靶点，敲除YTHDF2 可引起 GSCs 中广泛基因表达的改变，MYC 靶点显著富集，而且，GSCs 中获得 m6A 峰的基因更频繁地下调。通过 qPCR 也验证了YTHDF2 敲除对MYC、VEGFA mRNA 水平降低的作用。为了预测YTHDF2 在 GSCs 中的作用，作者结合 TCGA 胶质母细胞瘤基因表达数据，发现YTHDF2 相关基因MYC 和E2F 靶点以及G2M 调节因子和氧化磷酸化介质高度富集。这些数据表明YTHDF2 作为与 m6A 差异修饰相关的转录程序的调节因子。
图3 YTHDF2支持GSCs中重要癌症特异性通路的基因表达
4. YTHDF2 通过保持 MYC 转录稳定发挥 GSC 特异性依赖作用
为了确定YTHDF2 介导作用于 GSCs 中 MYC 的特异性，作者比较了在 NSCs 和 GSCs 之间YTHDF2 缺失的影响。NSCs 中YTHDF2 敲低并不影响MYCmRNA 水平，但降低了 GSCs 中MYCmRNA 水平。而且，YTHDF2 耗竭降低了GSC 的活性，而不影响 NSCs。因此，YTHDF2 代表了一种 GSC 特异性依赖，通过MYC 基因的特异性稳定支持胶质母细胞瘤的生存。
图4 YTHDF2 以 m6A 依赖的方式稳定了 GSCs 存活所需的癌基因的表达
5. IGFBP3 是 GSCs 中 YTHDF2-MYC 轴的下游靶点
因为IGFBP3 是YTHDF2 耗尽后最高下调基因之一，作者研究了IGFBP3 是否调控YTHDF2-MYC 轴下游的细胞活力。IGFBP3 的缺失降低了 GSC 的活性和细胞球形成。IGFBP3 过表达挽救了 GSCs 免于YTHDF2 下调介导的细胞死亡。最后，作者利用20个胶质母细胞瘤和20个非肿瘤脑组织中IGFBP3 的表达进行验证，观察到 GSC 中IGFBP3 mRNA 表达升高。结果表明，IGFBP3 是 GSCs 中YTHDF2-MYC 信号轴的关键下游效应子。
图5 YTHDF2-MYC 轴通过 IGFBP3 调控 GSCs 的活性
6. YTHDF2-MYC-IGFBP3 轴促进体内肿瘤生长
为了探讨在体内靶向YTHDF2 治疗的潜在益处，作者利用 CRISPR 敲除技术对原位异种移植物的小鼠进行检测。结果表明，与携带对照 sgRNA 的 GSCs 的小鼠相比，敲除YTHDF2 延长了肿瘤潜伏期并减少了肿瘤体积。IGFBP3 过表达恢复了YTHDF2 缺失的 GSCs 体内成瘤能力。
图6 YTHDF2-MYC-IGFBP3 轴促进体内肿瘤生长
研究结论
通过结合体外和体内的 GSCs 研究，该研究阐明了 m6A 介质在 GSCs 中的功能，并确定YTHDF2 是 GSCs 特异性依赖，通过稳定MYC 转录物调控 GSCs 中的葡萄糖代谢。这些发现为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。
文献二
2020年4月，上海交通大学医学院附属仁济医院洪洁团队在 Molecular Cancer 上发表了题为“m6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression”的研究论文。研究表明，靶向METTL3 及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。
研究背景
结直肠癌 (CRC) 是全球第四大常见恶性肿瘤和第三大癌症死亡原因，而以乳酸作为糖酵解的最终产物，被认为是治疗癌症的一种有前途的方法。m6A 调控基因的改变在多种人类疾病的发病机制中起着重要的作用，但 m6A 修饰是否在 CRC 的葡萄糖代谢中起作用尚不清楚。
研究方法
研究结果
1. METTL3与结直肠癌糖酵解密切相关
为了探讨结直肠癌（CRC）中 m6A 修饰与糖酵解代谢之间的相关性，作者对47例 CRC 患者进行 RT-PCR分析，CRC患者中FDG 摄取与METTL3 表达之间存在最显着的相关性。进一步分析发现 CRC 患者中 FDG 摄取与METTL3 免疫组化染色存在显著相关性。最后，作者利用 RNA-seq 比较METTL3 敲除和野生型(WT) HCT116 CRC 细胞的基因表达谱，METTL3敲除细胞表现出更高的 METTL3 表达。这些结果表明METTL3 可能介导 CRC 患者糖溶解代谢和癌变。
图1 在 CRC 中 METTL3 与糖酵解代谢密切相关
2.METTL3 在结直肠癌中促进糖酵解代谢
为了弄清METTL3 的改变是否直接影响糖酵解代谢，研究发现敲除METTL3 可显著降低 HCT116 和 SW480 细胞的胞外酸化速率(ECAR)水平，过表达 METTL3 显著提高了 DLD1 细胞的乳酸生成、葡萄糖吸收和ECAR 水平。为了阐明Mettl3 诱导的 CRC 糖酵解是否依赖于其甲基转移酶功能，作者通过Mettl3 野生型和突变型的研究，发现Mettl3 的 MTase 结构域的缺失阻断了Mettl3 诱导的糖酵解过程。这些数据表明Mettl3通过其甲基转移酶结构域调控结直肠癌糖酵解代谢。
图2 METTL3 在 CRC 中促进糖酵解代谢
3. 在结直肠癌中，METLC3 诱导的增殖依赖于糖酵解的激活
METLC3 的敲除消除了 HCT116 细胞的细胞增殖和集落形成，并且降低了 HCT116 肿瘤的生长和异种移植小鼠模型中的肿瘤重量。在功能分析中，METTL3 的过表达增加细胞增殖、集落形成、肿瘤的生长和肿瘤的重量。2-DG（糖酵解途径的抑制剂）处理在体外和体内显着阻断了METTL3 诱导的细胞增殖和菌落形成，这些结果表明Mettl3通过调控结直肠癌糖代谢促进 CRC 进展。
图3 METLC3诱导的细胞存活依赖于糖酵解代谢
4.METTL3 在结直肠癌中的潜在靶点
为了鉴定METTL3 的潜在靶标，作者选择了METTL3 敲除和 WT HCT116 细胞进行 MeRIP-seq和RNA-seq，最常见的motif ' GGAC '在 m6a 峰中显著富集，大部分 METTL3 结合位点位于 CDS区，在 5'UTR 和 3'UTR 高度富集，并且 m6A在转录水平上发生了全局低甲基化。联合RNA-seq数据，确定了429个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被下调，595个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被上调。基于甲基化水平与 mRNA 表达水平都下降，找到与糖酵解密切相关的靶基因HK2 和SLC2A1(GLUT1)。
图4 m6a -seq 和 RNA-seq 检测 METTL3 在结直肠癌中的潜在靶点
6. HK2 和 SLC2A1 是 METTL3 在 CRC 中重要的功能靶基因
作者通过 HCT116 WT 和mettl3 敲除细胞转染 control、HK2 或SLC2A1 过表达实验发现，HK2 或SLC2A1 的异位表达部分恢复了敲除mettl3 细胞的增殖、集落形成能力和肿瘤生长，而且，也能恢复 HCT116mettl3 敲除细胞中乳酸产量的下降。同时，在体外和体内，过表达SLC2A1 显著恢复了 HCT116mettl3 敲除细胞葡萄糖摄取下降的趋势。因此，HK2 和SLC2A1介导了 CRC 细胞中 METLL3 的调节功能。
图5 HK2 和 SLC2A1 是 CRC 中 METTL3 靶基因
研究结论
METTL3 是 CRC 的一种功能性和临床致癌基因。METTL3 通过 m6A-IGF2BP2/3—依赖机制稳定 CRC 中HK2 和SLC2A1的表达。靶向METTL3 及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。
参考文献
[1] Dixit D, Prager B, GimpleShen R, et al. The RNA m6A readerYTHDF2 maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells[J]. Cancer Discovery, 2020.
[2] Shen C, Xuan B, Yan T, et al. M6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression[J]. Molecular Cancer, 2020, 19(1).
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