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刘小泽写于19.7.9-第二单元第九讲：生物学背景知识之细胞周期推断
笔记目的：根据生信技能树的单细胞转录组课程探索smart-seq2技术相关的分析技术
课程链接在：http://jm.grazy.cn/index/mulitcourse/detail.html?cid=53
脚本：scRNA_smart_seq2/section01-RNA-seq/step6-cell-cycle.R
前言
上一次说到通过PAM50基因进行乳腺癌分型，利用的就是自己的表达矩阵和PAM50基因比较，看表达量变化进行分类。细胞周期分类和PAM50类似，也是利用基因来推断G、S、M期(https://en.wikipedia.org/wiki/Cell_cycle)
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Scran包使用
依然第一步是加载矩阵
rm(list = ls())
options(stringsAsFactors = F)
load(file = '../input.Rdata')
a[1:4,1:4]
>head(df)
g plate n_g all
SS2_15_0048_A3 1 0048 2624 all
SS2_15_0048_A6 1 0048 2664 all
SS2_15_0048_A5 2 0048 3319 all
SS2_15_0048_A4 3 0048 4447 all
SS2_15_0048_A1 2 0048 4725 all
SS2_15_0048_A2 3 0048 5263 all
# 放入分群、样本批次信息
> group_list=df$g
> plate=df$plate
> table(plate)
0048 0049
384 384
然后创建sce对象
library(scran)
sce <- SingleCellExperiment(list(counts=dat))
> sce
class: SingleCellExperiment
dim: 12198 768
metadata(0):
assays(1): counts
rownames(12198): 0610007P14Rik 0610009B22Rik ... ERCC-00170
ERCC-00171
rowData names(0):
colnames(768): SS2_15_0048_A3 SS2_15_0048_A6 ... SS2_15_0049_P22
SS2_15_0049_P24
colData names(0):
reducedDimNames(0):
spikeNames(0):
主要使用cyclone函数
cyclone函数主要需要三个元素：一个是sce单细胞对象，一个是pairs参数，还有就是gene.names参数。第一个已准备好，第二个参数的意思可以看帮助文档
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# scran包安装好后，会在exdata文件夹中找到附件文件
library(org.Mm.eg.db)
# syste,.file会列出文件所在的路径，下图就是exdata文件夹下的文件，看到除了小鼠还有人的相关的RDS数据。这个RDS其实和平常看到的Rdata差不多，只不过Rdata是针对多个对象，Rds是针对一个对象进行存储和读取
mm.pairs <- readRDS(system.file("exdata", "mouse_cycle_markers.rds",
package="scran"))
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然后是第三个参数：gene.names，cyclone函数需要使用ensembl基因名
# 将symbol转为ensembl基因
ensembl <- mapIds(org.Mm.eg.db, keys=rownames(sce),
keytype="SYMBOL", column="ENSEMBL")
> head(ensembl)
0610007P14Rik 0610009B22Rik 0610009L18Rik
NA "ENSMUSG00000007777" "ENSMUSG00000043644"
0610009O20Rik 0610010F05Rik 0610010K14Rik
NA "ENSMUSG00000042208" "ENSMUSG00000020831"
三者齐全，可以进行细胞周期计算：
system.time(assigned <- cyclone(sce, pairs=mm.pairs, gene.names=ensembl))
# 这一过程会比较慢，用system.time计算一下时间看看，大约一分半
# user system elapsed
# 96.229 0.767 104.666
save(assigned,file = 'cell_cycle_assigned.Rdata')
> str(assigned) # 包含了phases、scores、normalized.scores三个元素
List of 3
$ phases : chr [1:768] "G1" "G1" "G1" "G1" ...
$ scores :'data.frame': 768 obs. of 3 variables:
..$ G1 : num [1:768] 1 0.997 0.997 1 1 1 1 0.937 1 1 ...
..$ S : num [1:768] 0.119 0.002 0.039 0.011 0.395 0.009 0.011 0.008 0.04 0.013 ...
..$ G2M: num [1:768] 0.004 0.01 0.02 0.002 0 0 0.02 0.126 0 0.023 ...
$ normalized.scores:'data.frame': 768 obs. of 3 variables:
..$ G1 : num [1:768] 0.89 0.988 0.944 0.987 0.717 ...
..$ S : num [1:768] 0.10597 0.00198 0.03693 0.01086 0.28315 ...
..$ G2M: num [1:768] 0.00356 0.00991 0.01894 0.00197 0 ...
下面就根据assigned进行操作
> head(assigned$scores)
G1 S G2M
1 1.000 0.119 0.004
2 0.997 0.002 0.010
3 0.997 0.039 0.020
4 1.000 0.011 0.002
5 1.000 0.395 0.000
6 1.000 0.009 0.000
> table(assigned$phases)
G1 G2M S
723 34 11
# 作图(利用score和phases这两个元素)
draw=cbind(assigned$score,assigned$phases)
attach(draw) #attach的目的就是现在加载，之后直接引用即可
library(scatterplot3d)
scatterplot3d(G1, S, G2M, angle=20,
color = rainbow(3)[as.numeric(as.factor(assigned$phases))],
grid=TRUE, box=FALSE)
detach(draw)
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还能做个热图(就是在anno_col上不断加内容即可)
library(pheatmap)
# 取差异前100基因
cg=names(tail(sort(apply(dat,1,sd)),100))
# 矩阵归一化
n=t(scale(t(dat[cg,])))
# 原来的样本注释信息 df中包含了 g、plate 、n_g、all信息，现在新增phases信息
df$cellcycle=assigned$phases
ac=df
rownames(ac)=colnames(n)
pheatmap(n,show_colnames =F,show_rownames = F,
annotation_col=ac)
dev.off()
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其他资料：
seurat官网：Cell-Cycle Scoring and Regression
Seurat亮点之细胞周期评分和回归
单细胞分析实录(10): 消除细胞周期的影响
seurat 和scran 包 去除细胞周期
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