单细胞转录组揭示乳腺癌转移能量代谢改变

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背景简介

本文题为：Transcriptional diversity and bioenergetic shift in human breast cancer metastasis revealed by single-cell RNA sequencing，单细胞转录组揭示乳腺癌转移能量代谢改变。发表于2020年3月，主要涉及的背景知识为肿瘤转移与肿瘤能量代谢。 肿瘤转移是肿瘤死亡的主要因素，主要过程为侵袭转移级联反应，包括以下五个步骤（括号内为涉及的相关机制）：
①原发肿瘤细胞向周围组织局部侵袭。（EMT）
②肿瘤细胞进入血管，并在循环系统中生存。（CTC）
③肿瘤细胞局部停滞，出血管壁，进入远端组织实质。（TEM，跨内皮迁移）
④在远处实质中形成微转移克隆。（DTC）
⑤微转移灶增殖至临床可见。（定植，种子与土壤学说）

肿瘤能量代谢最著名的特点为Waburg效应，即在氧气充足的情况下，肿瘤细胞糖酵解增强，氧化磷酸化被抑制，大量葡萄糖通过有氧糖酵解产生乳酸。肿瘤为何产生Waburg效应一直是肿瘤糖代谢的研究重点，主要有以下几类假说：
① 肿瘤细胞通过糖酵解产生大量中间产物用于其他物质代谢途径，如氨基酸和核苷酸的合成，满足肿瘤快速增殖的需要。
② 无氧呼吸可以避免呼吸链产生大量氧自由基，从而避免细胞凋亡。
③ 无氧呼吸产生大量乳酸，使局部pH降低，一方面通过促进基质细胞凋亡促进肿瘤侵袭转移，另一方面通过驯化免疫细胞，产生免疫抑制的环境，帮助肿瘤免疫逃逸。

文献链接：https://www.nature.com/articles/s41556-020-0477-0

摘要

虽然肿瘤转移是肿瘤相关的主要死因，但其机制仍知之甚少。在此，我们使用单细胞测序技术和人源异种移植乳腺癌模型，建立了一种稳健的方法，以识别播散期罕见转移癌细胞转录组的全局改变。我们发现原发肿瘤和微转移瘤均表现出转录异质性，但微转移在病人源性异种移植模型中存在一个独特的转录组程序，该程序可高度预测病人的不良生存。通路分析显示氧化磷酸化是微转移瘤上调的top通路，而原发性乳腺癌则展现出糖酵解酶上调。流式分析和代谢组分析证实了这一结果。药物抑制氧化磷酸化显著减弱肿瘤转移至肺，表明氧化磷酸化是在转移中的功能重要性，并强调其作为防止乳腺癌患者的转移扩散治疗靶点的潜力。

方法

①流式抗体：

人特异性抗体CD298 (diluted 1:100; PE; BioLegend, cat. no. 341704)

鼠特异性抗体MHC-I (diluted 1:150; APC; Thermo Fisher Scientific, cat. no. 17-5957-80)

细胞活力negative staining with SYTOX blue (diluted 1:1,000; Thermo Fisher Scientific, cat. no. S34857)

人类原发与转移癌 gating on Sytox−CD298+MHC-I− cells.

线粒体膜电位读数TMRM (diluted 1:500; Thermo Fisher Scientific, cat. no. T668), MitoTracker-Green (diluted 1:100 from a 10 μM stock; Thermo Fisher Scientific, cat. no. M7514), human-specific antibody CD298 (diluted 1:100; APC; BioLegend, cat. no. 341706) and the mouse-specific antibody MHC-I (diluted 1:100; PE/Cy7; BioLegend, cat. no. 114717).

寡霉素处理后细胞活力测定annexin V-FITC (diluted 1:100; GeneTex, cat. no. GTX14082) and propidium iodide (diluted 1:100; Thermo Fisher Scientific, cat. no. P3566).

②ScRNA-seq：

总共3个TNBC病人，9只人源异种移植小鼠，样本来源于小鼠乳腺原发肿瘤、淋巴结微转移、肺微转移

上游处理：SmartSeq2流程，测序平台为HiSeq2500，比对Bowtie 2，定量RSEM，定量结果为log2（TPM+1），载入Seurat。

细胞质量控制：去除基因数少的细胞(<2,500 genes per cell)，去除线粒体含量高的细胞（>50%）

基因质量控制：去除表达细胞量少的基因(<8 cells per gene)

批次效应矫正：利用Seurat中的RegressOut功能，我们使用nGene和percent. Mito当作协变量计算z-score残差，进行主成分分析和tSNE分析。G1/S和G2/M评分采用下面描述的基因评分法计算，针对样本HCI001和HCI010进行回归。

降维、聚类、细胞识别、差异表达、富集分析：Seurat v 2.1.0、Enrichr

③识别候选生物标志物用于logistic回归建模：

对每一个基因z-score标准化。为了进行模型拟合，从每个小鼠和细胞类别(肿瘤与微转移)中均等抽样10次，以避免系统偏差。对于每一次采样，都进行了向前选择的逐步回归，每一步都选择最小化Akaike信息准则的模型作为下一步的基础模型。我们的逻辑回归模型使用了基于Akaike信息标准图中肘点的五个基因的保守阈值来最小化我们的基因集的大小，同时保持模型的描述能力。（即我们通常所说的AIC法）

④基因集分数：

基因集来自KEGG数据库，打分使用Seurat的AddModuleScore()功能

⑤生存分析：

RFS，K-M曲线，KM Plotter database，top20微转移相关基因。其中2个基因无统计学差异，3个基因无对应探针，其余15个基因计算平均值，阈值使用‘auto select best cutoff ’

⑤其他

①耗氧速率oxygen-consumption rate (OCR)与细胞外酸化率extracellular acidification rate (ECAR)：海马生物科学XF24细胞外通量分析仪(Agilent)

②荧光寿命成像fluorescence lifetime imaging (FLIM)：倒置激光扫描共聚焦显微镜；数据分析：SimFCS，用于分析游离NADH和结合NADH含量。

③代谢组LC–HRMS，分析软件MetaboAnlyst，https://www.metaboanalyst.ca/

④本文数据：GSE123837，同时提供GitHub代码。

主要结果

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图一：单细胞转录组测序流程，此处图D也验证了上次推文单细胞转录组分析肿瘤异质性的结论：病人间异质性较大。同时还得出了新的结论：原发肿瘤细胞与微转移肿瘤细胞间异质性较小。从图c的HE染色可以看出，微转移肿瘤在肺中散在分布，呈现多克隆的感觉。

随后，针对三个样本分别分析，以探索瘤内异质性。

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此处针对样本的细胞周期进行探索，发现1号和10号病人样本聚类结果主要由细胞周期驱动（如中间的图所示），因此矫正细胞周期批次效应。此处数据处理非常细心，值得学习，也可以类似地探索文库大小、基因数目、线粒体比例等因素。

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图二：降维聚类结果，微转移癌与原发癌均分布于每一个cluster，表明微转移癌与原发癌均具有瘤内异质性，其中A1、B1、C2、C3微转移癌比例较大，具有细胞状态的倾向性。

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图三：微转移细胞表现出独特的转录组特征。

Tobit检验，330个差异基因，P < 0.05, min.pct = 0.1, log[FC] threshold = 0.25

鉴定出多个之前未知与转移相关的差异基因，如CKB, PHLDA2, NME1, ASHA1, NOP16 and S100A16，见图c，差异明显。

识别与预后相关的基因，K-M plotter数据库，选择basal-like breast cancer（879 patients），前20个基因里有15个与较差预后相关。（阈值P < 0.05, hazard ratio (HR) ≥ 1.4;）综合15个基因结果也有显著差异。（图d）

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利用抽样的方法针对330个基因构建logistic模型，共计构建10个模型，最终，PHLDA2是微转移细胞的首选候选，并且存在于10个模型中的8个模型。该基因是一个母系印记基因，在体外调节胎盘生长，增加异种移植物的移植物定植和细胞侵袭，但与乳腺癌转移的关系有限。

在原发肿瘤中该基因仅在少量细胞表达（图三e），作者认为这些表达PHLDA2的细胞可能是转移前细胞。这些结果强调了单细胞数据可以用于识别转移性肿瘤的潜在驱动因素，预测乳腺癌患者转移进展的生物标志物。

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图四：微转移细胞展现出氧化磷酸化活性增高。

图a针对330个基因的GO富集结果，大多数微转移通路富集于呼吸链、线粒体代谢、OXPHOS等通路，表明氧化磷酸化在微转移细胞中升高；而原发肿瘤富集于EMT、糖酵解、ECM组织、血管生成等，均为原发肿瘤的常见标志。这份数据分析结果非常集中，这与作者之前细致的工作是密不可分的，因此我们在正式数据分析时，一定要检查细胞周期、线粒体含量、基因数量等因素是否产生了明显批次效应。

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流式结合代谢组验证以上结果：微转移细胞展现出氧化磷酸化活性增高。

TMRM流式分析可展示膜电位情况，如左图，TMRM高，膜电位高，TMRM低，膜电位低。图中显示微转移肿瘤细胞TMRM膜电位高。

图e下方qPCR检查TMRM高低表达细胞线粒体生物氧化和呼吸链基因表达量，显示表达量确实均升高。

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图五：（6个肺转移与原发肿瘤配对样本）此处为代谢组验证，结果发现微转移细胞与原发肿瘤细胞存在整体代谢组差异。尽管由于转移病灶的细胞数量有限，较少的丰富代谢物低于检测的限度，但对150个已识别的代谢物的分析表明，转移细胞表现出独特的代谢特征。

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图六：氧化磷酸化对于乳腺癌肺转移至关重要。

使用复合体V抑制剂oligomycin寡霉素，使细胞糖代谢转向糖酵解途径，测量其对肺转移的影响。由于寡霉素具有毒性，此处还测定了细胞的健康和代谢状态。主要结果为图gh。

之后还证明了寡霉素对于原发肿瘤生长无显著影响，仅对转移起作用。

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思考

本文通过分析人源异种移植小鼠原发肿瘤与微转移肿瘤的单细胞测序数据，得出原发肿瘤中普遍存在的有氧糖酵解代谢特征，在转移过程中丢失，微转移肿瘤重新获得氧化磷酸化的能力。本文大部分工作均是单细胞转录组的常规分析，中途加入K-M plotter数据库的生存数据，说明原发肿瘤与微转移肿瘤细胞之间差异基因具有较强的临床相关性，同时利用logistic回归建模找到区分原发肿瘤与微转移肿瘤细胞的关键基因。

本文最终落脚点并非在基因水平，而是通路水平，通过富集分析找到的通路非常集中，均为氧化磷酸化相关的通路，这与作者前期细致的预处理的密不可分的。

本文得出结论后的验证工作也非常扎实，既有流式和代谢组验证，又有寡霉素抑制复合体V的基础实验验证，多种方法验证同一个结论让作者研究结果非常可信。

总而言之，本文得出重要结论的关键不在于生物信息分析方法的高大上，而在于细致的预处理、分析结果的精准解读与严谨准确的实验验证。