✎ 文章导读
文章标题：Microbial exposure during early human development primes fetal immune cells
发表期刊：Cell /2021-06
样本入组：妊娠中期胎儿组织（肠道、肺、皮肤、胸腺、肝脏、肠系膜淋巴结）、外周血
文章结果：1）妊娠中期胎儿显示具有效应记忆T细胞表型的多样性；2）胎儿器官中存在少量微生物；3）胎儿器官中可培养微生物能够体外诱导激活胎儿肠系膜淋巴结记忆T细胞；
人类胎儿免疫系统在妊娠早期时就开始发育，其免疫系统具有多样性，然而导致免疫系统启动的因素仍未确定。因此，新加坡A*STAR的相关工作人员利用质谱流式细胞技术（CyTOF) 研究了妊娠中期（第12-24周，来自由于社会心理原因而中止妊娠的健康胎儿）的胎儿多种组织的免疫细胞图谱，并通过16s RNA及扫描电镜（SEM）等探测了胎儿组织中及肠腔中微生物的多样性。研究发现胎儿组织中存在微生物，并能够激发胎儿免疫系统的启动。该研究对理解胎儿出生前免疫系统的建立具有重要意义。
文章研究思路
妊娠期胎儿T细胞具有多样性
研究人员首先利用CyTOF剖析了胎儿的肺、皮肤、肠道、胸腺、肝脏、肠系膜淋巴结（MLN）以及外周血中的T细胞组成。研究发现外周血与组织聚类成不同的亚群，表明妊娠期胎儿器官具有T细胞特异性（Fig 1. A-C）。对组织进一步分析发现，胎儿组织中Tregs细胞富集，且高表达PD1+Ki67+，表明慢性TCR活化、活性增殖以及免疫耐受性。此外，研究发现胎儿组织中富集具有记忆性的Tem细胞，表明胎儿体内存在抗原刺激，能够刺激胎儿器官中的T细胞活化(Fig 1. D-I)。
Fig 1.胎儿发育过程中T细胞具有多样性
胎儿组织器官中存在微生物信号
既然胎儿组织中存在免疫细胞活性，那是什么引起的呢？因此研究人员利用16s RNA测序技术进行了微生物存在及属性鉴定。研究发现胎儿组织中的α-多样性，β-多样性显著高于PBS阴性对照。有趣的是，与内部组织相比，外部或表面暴露的胎儿组织中具有更丰富的微生物多样性。该研究结果同CyTOF数据一致(Fig 2. D-F)。进一步研究发现胎儿组织中富集的微生物属性具有组织异质性。胎儿组织中富集的微生物包括黄杆菌，乳酸菌，葡萄球菌，阿菲波菌属，假单胞菌，慢生根瘤菌和短波单胞菌等（ Fig 2.G）。
Fig 2.胎儿组织中存在微生物
微生物可诱导T细胞扩增和记忆活性
前面的研究证明了胎儿器官组织中存在微生物，那这些微生物是否具有活性呢？因此研究人员在厌氧条件下将新鲜获取的胎儿组织活检接种在培养基中，研究发现不同组织培养形成的菌落形态大小不同，进一步说明不同器官中的微生物具有异质性(Fig 3. A-B)。胎盘和皮肤中菌群种类高于肺部和肠道，同从外部到内部暴露胎儿器官的微生物多样性梯度下降一致（Fig 3. C-D）。此外，研究人员还通过扫描电镜观察到胎儿肠道内存在离散的菌群结构，通过RNA原位杂交，进一步得到了胎儿肠腔内细菌RNA的定位，细菌紧密排列在肠上皮。这些结果表明，妊娠中期的胎儿器官组织尤其是肠道内，存在微生物。
Fig 3.胎儿组织微生物具有活性
胎儿组织中微生物可诱导T细胞扩增和记忆细胞活化
那这些微生物的存在是否与胎儿免疫系统密切相关呢？鉴于先前研究发现胎儿树突状细胞（DC）可以迁徙到胎儿mLN中，可能使胎儿mLN中的T细胞暴露于微生物抗原，进而引发免疫响应。因此，研究人员分选胎儿的DC细胞并与热失活的乳酸菌和葡萄球菌孵育后，与分选的胎儿T细胞共培养（Fig 4. A），以检测T细胞的活化情况。研究发现，暴露于微生物诱导后的DC细胞后，T细胞数量显著增加（Fig 4. D-H）。有趣的是，与乳酸菌相比，葡萄球菌诱导的树突状细胞的T细胞扩增量始终较高，这表明胎儿T细胞反应存在细菌特异性。此外，记忆T细胞（CD45RO+）以及CD69+记忆T细胞占比增多，表明微生物暴露后记忆细胞的早期激活及潜在记忆。
Fig 4. 分离自胎儿的可培养菌能在体外诱导激活胎儿肠系膜淋巴结记忆T细胞
DC抗原呈递可驱动大量T细胞活化
最后，研究人员用多聚甲醛（PFA）处理树突状细胞后观察T细胞活化情况，以进一步确定T细胞活化是否由DC抗原呈递引发的。研究发现非固定树突状细胞诱导的T细胞激活与扩增，显著高于PFA固定后的树突状细胞。这些结果表明微生物暴露对于胎儿T细胞扩增的影响是由抗原呈递和细胞因子介导的信号通路共同作用的。此外，抗原呈递本身就足以驱动大量T细胞活化。
小编总结
（1）该研究开创性以妊娠期胎儿为研究对象，利用高通量流式细胞技术（CyTOF）深入剖析了胎儿多组织中的免疫微环境，并通过严谨的实验设计和多种互补技术（16s，SEM等），验证了胎儿器官中微生物的存在及活性。最后，通过对微生物存在对胎儿T细胞的激活研究证实了胎儿体内微生物在胎儿早期免疫发育中发挥重要作用。该研究对了解参与胎儿免疫系统发育和子宫内免疫启动的关键因素具有广泛的意义。（2）如作者文中提到的，后续还需要进一步探索人类胎儿器官中这些T细胞-微生物相互作用的抗原特异性，以及与非抗原特异性（细胞因子介导的）的协同反应对增殖程度的影响。在免疫相关研究中，传统的荧光流式在系统表征免疫表型和响应时能提供的信息相对有限，而质谱流式细胞技术（CyTOF），不仅能表征不同状态下免疫细胞的组成差异，还能深入剖析相关的功能蛋白、细胞因子表达，能够为深入揭示免疫调控机制提供更丰富的信息。
【参考文献】
Mishra A, et al. Microbial exposure during early human development primes fetal immune cells. Cell. 2021.
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